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敲降ZEB1基因表达 对人脂肪间充质干细胞增殖、周期与凋亡的影响
目的 探讨敲降ZEB1基因表达对人脂肪间充质干细胞(hADSCs)增殖、周期和凋亡的影响.方法 胶原酶消化法提取人脂肪组织中原代间充质干细胞,对其进行免疫学表型、成骨和成脂分化能力鉴定后用于实验.脂质体转染法将siRNA转入hADSCs,实时定量PCR和Western blot检测ZEB1、细胞增殖、周期和凋亡相关基因mRNA和蛋白的表达.MTS法检测细胞增殖.流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡率.结果 与si-NC转染组相比,si-ZEB1转染组可使ZEB1 mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.01),细胞增殖能力明显下降(P<0.05),增殖相关基因CCND1、MKI67、MYC和PCNA表达显著下调(P<0.05或P<0.01);G1期细胞比例从50.71%增加到58.94%(P<0.01),S期和G2期细胞比例分别减少了6.16%和2.07%;细胞凋亡率上升了10.2%,促凋亡相关基因TP53和BAX表达上调,抗凋亡基因MCL1和BCL2表达下调(P<0.05或P<0.01).结论 ZEB1具有促进hADSCs增殖和周期进展,抑制细胞凋亡的作用.
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人脂肪间充质干细胞在聚ε-己内酯材料上转分化为内皮细胞
目的 研究人脂肪来源的间充质干细胞(hADSCs)在聚ε-己内酯共聚物上的附着和增殖能力及分化为内皮细胞的能力.方法 选择材料孔径为60-80 μm(小孔径)和180～200 μm(大孔径),并计算在14 d内的吸水率和降解率.将hADSCs种植在不同孔径的材料上,计算接种率.利用DAPI免疫荧光标记及扫描电镜观察hADSCs的生长及分布情况,用CCK-8法绘制hADSCs增殖曲线.在材料上含有40 ng/mL VEGF和10 ng/mL bFGF的培养基上培养30 d后,用流式细胞术检测vWF和VE-cadherin,免疫荧光检测Flk-1.结果 在小及大孔径材料上14 d的吸水率分别为200%和216.7%,降解率为13.3%和21.7%.hADSCs呈长梭形依附于多孔材料表面.小孔径的细胞接种率为98.3%±0.3%,明显大于大孔径的90.3%±1.5%(P<0.05);增殖曲线亦是如此.在小孔径上分化50 d后,vWF和VE-cadherin的阳性率分别为80.9%±0.9%和84.3%±1.1%,大多数细胞表面均表达Flk-1.结论 hADSCs较适合在孔径为60-80 μm聚ε-己内酯共聚物材料上生长和增殖,并可在材料上有效分化为内皮细胞.
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明胶微冰胶支架有利于脂肪来源间充质干细胞体外干性维持并提高其体内应用价值
目的 研究人脂肪来源间充质干细胞(ADSCs)与明胶微冰胶材料体外联合培养时,材料是否能维持间充质干细胞的生物学特性.方法 ADSCs种植于明胶微冰胶材料后进行Calcein-AM和PI活细胞染色检测细胞活力,细胞滴度蓝法检测细胞增殖能力,定量PCR检测干性基因OCT4、Nanog、SOX2表达情况,以及在成脂成骨诱导过程比较ADSCs在二维环境和种植于明胶微冰胶材料后的分化潜能.结果 ADSCs在三维明胶微冰胶支架材料中能保持较高活性,增殖能力不受影响,干性基因表达上调,成脂成骨分化相关基因表达水平比二维诱导环境低.结论 明胶微冰胶可以为ADSCs提供一个较二维培养更好的微环境,有利于ADSCs体外干性维持,从而在干细胞移植法治疗相关疾病时以非侵入性的细胞传递方式发挥更长期的应用价值.
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聚乙烯亚胺包被的Fe3O4磁纳米颗粒对hADSCs生物学特性的影响
目的 探讨聚乙烯亚胺(PEI)包被的超顺磁性氧化铁(spIo)对人脂肪间充质干细胞(hADSCs)生物学特性的影响.方法 从人皮下脂肪组织中分离、培养hADSCs并鉴定,选取第3代hADSCs,分别用含铁浓度为6、8、10和12 mg/L的DMEM/F12培养液共孵育.通过普鲁士蓝染色、MTT细胞增殖实验、锥虫蓝染色及多向分化诱导实验来探讨PEI-SPIO标记后,hADSCs的标记能力、细胞增殖和分化能力.结果 1)当铁终浓度为8、10和12 mg/L时,PEI-SPIO对hADSCs的标记率为99％,当铁终浓度＜8 mg/L时,PEI-SPIO对hADSCs的标记率为96％.2)当铁终浓度为6和8 mg/L时,PEI-SPIO标记的hADSCs的活细胞比率为99％,而当铁终浓度为10和12 mg/L时,活细胞比率为(79.03±2.25)％和(70.23±1.36)％,显著低于对照组(P＜0.01).3)当铁浓度为10和12 mg/L时,在诱导hADSCs分化过程中,细胞绝大多数死亡.结论 铁浓度8 mg/L为PEI-SPIO标记的适宜浓度,既能高效的标记hADSCs,又不影响hADSCs的细胞增殖、多向分化能力等生物学特性.
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体外分离培养人脂肪间充质干细胞及鉴定
目的：建立体外分离培养人脂肪间充质干细胞（hADSCs）的方法。方法采用酶消化法分离培养 hAD-SCs，流式细胞仪检测细胞免疫表型，台盼蓝染色计数绘制细胞生长曲线并计算倍增时间，油红和 Von Kossa 鉴定成脂成骨多向分化能力。结果成功从脂肪中分离纯化得到 hADSCs，呈放射状、河流状的梭形细胞。流式结果显示 hADSCs高表达 CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和 CD166等，低表达或不表达 CD45和 HLA - DR。生长曲线和倍增时间显示自我更新及增殖能力强。成脂和成骨染色显示其有多向分化能力。结论实验表明建立了一种有效的 hADSCs 体外分离培养方法。
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人脂肪间充质干细胞移植结合跑台训练对脊髓损伤大鼠运动功能的影响及机制
目的:探讨人脂肪间充质干细胞(hADSCs)结合跑台训练对脊髓损伤(SCI)大鼠运动功能的影响.方法:成年雄性SD大鼠60只,采用改良Allen打击法制作T10不完全SCI模型.术后随机分为损伤组(模型组,未行处理)、细胞移植组(细胞组,行细胞移植)、跑台训练组(训练组,行跑台训练)和跑台训练结合细胞移植组(联合组,行跑台训练及细胞移植).术前及术后采用BBB评分和Tarlov评分行运动功能评定,术后1、2、4周取脊髓行免疫荧光染色检测细胞存活,炎症反应相关细胞(ED1阳性巨噬细胞),胶质瘢痕[胶质纤维酸性蛋白,GFAP及神经丝蛋白(NF-200),5-羟色胺(5-HT)].结果:治疗组行为学评分及荧光定量检测均优于模型组(P＜0.05);但联合组明显,训练组和细胞组间无明显区别(P＞0.05).结论:hADSCs移植联合跑台训练对不完全性SCI大鼠运动功能恢复具有协同功效,治疗机制可能与进一步减轻伤后炎症反应,减少损伤面积,促进轴突再生有关.
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载脂蛋白A5对人脂肪间充质干细胞成脂分化的影响及其机制的实验研究
目的 探讨载脂蛋白A5(ApoA5)对人脂肪间充质干细胞(AMSC)成脂分化的影响及其机制.方法 脂肪组织来源于2015年2至7月在中南大学湘雅二医院进行腹部外科手术治疗的40例患者,以手术方法获取患者皮下脂肪组织,经胶原酶消化法得到人AMSC后诱导分化为成熟脂肪细胞,分别以600、1200 ng/ml ApoA5蛋白干预细胞,即为ApoA5600 ng/ml组、ApoA51200 ng/ml组,并以不加ApoA5蛋白干预的细胞为对照组.于诱导分化后第7、14天收获细胞,进行以下检测:通过甘油三酯(TG)检测试剂盒检测ApoA5对TG含量的影响;通过实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测ApoA5对脂肪酸结合蛋白(aP2)、脂肪酸合酶(FAS)等成脂分化标志物mRNA表达的影响;通过RT-qPCR和Western blot法检测ApoA5对诱导细胞死亡的DFF45样效应因子C(CIDEC)mRNA和蛋白表达的影响;通过RT-qPCR和Western blot法检测ApoA5对CCAAT/增强子结合蛋白β(C/EBPβ)mRNA和蛋白表达的影响.利用慢病毒转染技术,在AMSC中过表达CIDEC,分为慢病毒阴性对照组、慢病毒过表达CIDEC组及慢病毒过表达CIDEC+ApoA5组(ApoA5干预浓度为1200 ng/ml),检测在CIDEC过表达的情况下ApoA5对AMSC成脂分化过程中上述指标的影响.结果 (1)ApoA5对AMSC中TG含量的影响:干预后第7、14天,ApoA5600和1200 ng/ml组AMSC中TG含量均低于对照组(P均<0.05).(2)ApoA5对AMSC中aP2和FAS mRNA表达水平的影响:干预后第7天,ApoA5600和1200 ng/ml组AMSC中aP2、FAS mRNA表达水平均明显低于对照组(P均<0.05).干预后第14天,ApoA5600和1200 ng/ml组AMSC中aP2、FAS mRNA表达水平均进一步低于对照组(P均<0.05).(3)ApoA5对AMSC中CIDEC mRNA和蛋白表达水平的影响:干预后第7天,ApoA5600、1200 ng/ml组AMSC中CIDEC mRNA及蛋白表达水平均明显低于对照组(P均<0.05).干预后第14天,ApoA5600和1200 ng/ml组AMSC中CIDEC mRNA及蛋白表达水平均进一步低于对照组(P均<0.05).(4)ApoA5对AMSC中C/EBPβmRNA和蛋白表达水平的影响:干预后第7天,ApoA5600、1200 ng/ml组AMSC中C/EBPβmRNA及蛋白表达水平均明显低于对照组(P均<0.05).干预后第14天,ApoA5600和1200 ng/ml组AMSC中C/EBPβmRNA及蛋白表达水平均进一步低于对照组(P均<0.05).(5)CIDEC过表达后ApoA5对AMSC中TG含量的影响:干预后第7、14天,慢病毒过表达CIDEC组AMSC中TG含量均高于慢病毒阴性对照组(P均<0.05),而慢病毒过表达CIDEC组AMSC中TG含量与慢病毒过表达CIDEC+ApoA5组比较差异则均无统计学意义(P均>0.05).(6)CIDEC过表达后ApoA5对AMSC中aP2和FAS mRNA表达水平的影响:干预后第7天,慢病毒过表达CIDEC组AMSC中aP2、FAS mRNA表达水平均高于慢病毒阴性对照组(P均<0.05).干预后第14天,慢病毒过表达CIDEC组AMSC中aP2、FAS mRNA表达水平均进一步高于慢病毒阴性对照组(P均<0.05).而干预后第7、14天,慢病毒过表达CIDEC组AMSC中aP2、FAS mRNA表达水平与慢病毒过表达CIDEC+ApoA5组比较差异均无统计学意义(P均>0.05).(7)CIDEC过表达后ApoA5对AMSC中C/EBPβmRNA和蛋白表达水平的影响:干预后第7天,慢病毒过表达CIDEC组AMSC中C/EBPβmRNA和蛋白表达水平均高于慢病毒阴性对照组(P均<0.05).干预后第14天,慢病毒过表达CIDEC组AMSC中C/EBPβmRNA和蛋白表达水平均进一步高于慢病毒阴性对照组(P均<0.05).而干预后第7、14天,慢病毒过表达CIDEC组AMSC中C/EBPβmRNA和蛋白表达水平与慢病毒过表达CIDEC+ApoA5组比较差异均无统计学意义(P均>0.05).结论 ApoA5可抑制AMSC成脂分化,而这一作用可能是通过下调成脂分化关键因子CIDEC的表达实现的.
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人脂肪间充质干细胞在聚乳酸-羟基乙酸上的黏附、增殖与分化能力
目的 探讨人脂肪间充质干细胞在可降解骨基质材料聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)上的黏附、增殖和分化能力,为进一步体内回植提供实验依据.方法 等比混合聚乳酸(PLA)和聚乙醇酸(PGA),有机溶剂注模法制备PLGA.体外培养人脂肪间充质干细胞,复合PLGA,通过扫描电镜观察人脂肪间充质干细胞在PLGA上的黏附、增殖,以及在成脂诱导情况下细胞形态的变化.结果 合成的PLGA呈多孔状,孔隙率为85 % ,孔径为100～400 μm.人脂肪间充质干细胞可在PLGA上黏附、增殖、分泌细胞外基质,并可在成脂诱导剂的作用下分化为圆形的成脂样细胞.复合后14 d,人脂肪间充质干细胞和细胞外基质已将基质材料颗粒完全覆盖.结论 人脂肪间充质干细胞能在PLGA上黏附、增殖,PLGA可作为人脂肪间充质干细胞的载体和组织工程的支架材料.
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人脂肪间充质干细胞的分离培养及冻存前后生物学变化
目的 有效地分离并扩增人脂肪间充质干细胞(hADSCs),并观察冻存前后hADSCs的一般生物学特征.方法 采用Ⅰ型胶原酶消化的方法从抽脂手术废弃的脂肪组织中分离hADSCs,接种在人脂肪间充质干细胞完全培养基中培养.采用胰酶消化法传代扩增,取处于生长对数期的第3代细胞,以液氮冻存6个月.复苏后以台盼蓝染色检测细胞存活率,MTT法描绘细胞生长曲线；以流式细胞仪检测冻存前后细胞表面分子CD44、CD105、CD29、CD73、CD31、HLA-DR的表达水平.结果 细胞大小均等,呈长梭形漩涡状生长.复苏后细胞存活率可达(91.25±3.02)％；冻存前后细胞生长曲线无明显差别,均呈“S”形；经过2～3 d潜伏期后进入增殖期,7d后进入平台期.冻存前CD44、CD105双阳性细胞占(99.850±0.001)％,CD29、CD73双阳性细胞占(92.600±0.028)％,CD31阳性细胞占(4.186±0.010)％,HLA-DR阳性细胞占(1.02±0.007)％；冻存后CD44、CD105双阳性细胞占(98.060±0.028)％,CD29、CD73双阳性细胞占(91.224士0.041)％,CD31阳性细胞占(3.832±0.009)％,HLA-DR阳性细胞占(1.514±0.006)％.冻存前后上述6种hADSCs表面分子表达水平差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 来源于人的脂肪间充质干细胞易于体外培养扩增和冻存,复苏后存活率高,一般生物学特征无明显变化,可用作组织工程的种子细胞.
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骨形态发生蛋白-2-磷酸钙共沉淀支架与人脂肪间充质干细胞构建新型组织工程化骨
目的:构建可缓释骨形态发生蛋白-2 (bone morphogenetic protein-2,BMP-2)的仿生磷酸钙(biomimetic calcium phosphate,BioCaP)共沉淀三维支架(BMP-2-coprecipitated biomimetic calcium phosphate,BMP-2-BioCaP),检测其理化特性,探究其对人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived stem cells,hASCs)体内外成骨分化的影响,终构建以hASCs和BMP-2-BioCaP为基础的新型组织工程化骨.方法:构建BMP-2-BioCaP三维缓释支架,扫描电子显微镜观察表面形貌,体外检测其缓释能力.将BMP-2-BioCaP颗粒分别浸泡于增殖培养基(proliferation medium,PM)与成骨诱导培养基(osteogenic medium,OM)中,每2天提取上清液用于hASCs的体外培养.CCK-8实验检测各组hASCs的体外增殖能力,诱导7d及14 d后进行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色及活性定量检测,14 d及21 d进行茜素红染色及矿化沉积定量分析,4d及14 d检测成骨相关基因的表达情况.体内实验使用6只裸鼠,于其背部正中做皮肤切口,向两侧共分离出4个皮下植入腔,分别植入:(1)单纯BioCaP支架,(2)BioCaP支架+hASCs,(3) BMP-2-BioCaP缓释支架,(4) BMP-2-BioCaP缓释支架+hASCs(实验组).植入4周后取材,标本制成组织学切片进行HE染色观察.结果:BioCaP表面由不规则晶体组成三维立体多孔结构,孔直径约为5～10 μm,加入BMP-2后,不影响BioCaP原有的立体结构.缓释曲线结果显示,蛋白质在前2天释放速度较快,随后释放速度放缓并于5d后趋于平稳,之后每天释放量较稳定,至第21天仍有少量释放,累积释放量达20％.CCK-8结果显示,BMP-2-BioCaP缓释支架不会影响hASCs的早期增殖.诱导7d与14 d后,OM+ BMP-2-BioCaP组ALP染色及活性定量检测均显著高于其他组(P＜0.01).诱导21 d后,OM+ BMP-2-BioCaP组矿化结节染色及钙沉积定量检测均高于其他组(P＜0.01).诱导4d时OM+ BMP-2-BioCaP组的Runt相关转录因子2基因(Runt-related transcription factor 2,RUNX2)与ALP基因表达水平较对照组显著升高(P＜0.01),诱导14 d时RUNX2、ALP、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和骨钙素(osteocalcin,OC)基因表达量均显著高于其他组(P＜0.01).HE染色分析可见,实验组和BMP2-BioCaP缓释支架组中,细胞外基质呈强嗜酸性,出现类似骨陷窝的结构,并可见包含其中的类骨细胞.与BMP-2-BioCaP缓释支架组相比,实验组的细胞外基质嗜酸性更强,类骨组织的面积更大,结构更加典型,其他组未见矿化基质和类骨组织形成.结论:BMP-2-BioCaP支架能够实现BMP-2的良好缓释,并能显著促进hASCs的体内外成骨分化,以hASCs和BMP-2-BioCaP为基础构建的新型组织工程化骨具有潜在的应用前景.
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人脂肪间充质干细胞体外诱导为肝脏样细胞的试验研究
目的 探讨人脂肪间充质干细胞体外分离、培养、鉴定及向肝脏样细胞分化的方法.方法 采用胶原酶Ⅰ消化离心法获得人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells,hADSCs),原代培养并采用流式细胞仪检测干细胞相关表面抗原白细胞分化抗原13(Cluster differentiation13,CD13)、CD73、CD34、CD45和人类白细胞DR抗原(human leukocyte antigen DR,HLA-DR)的表达,采用诱导培养基将hADSCs向成脂及成骨方向诱导.采用两阶段细胞因子诱导法诱导hADSCs,并观察其形态变化;采用实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)法及细胞免疫组化法检测肝细胞相关基因甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)、细胞角蛋白18抗体(cytokeratin18,CK18)、细胞角蛋白19抗体(cytokeratin19,CK19)等在肝脏样细胞中的表达;采用糖元染色法(Periodic acid-Schiff stain,PAS)检测肝脏样细胞糖原合成情况.结果 用消化离心法获取的hADSCs大小均匀,呈梭形的成纤维细胞样,体外能长期培养存活,并保持不分化状态;流式细胞仪检测显示hADSCs高表达CD13、CD73,低表达CD34、CD45及HLA-DR;hADSCs体外可被诱导成脂肪细胞及成骨细胞.hADSCs经成肝诱导后,细胞形态由梭形变为多角形的肝脏样细胞,这些肝脏样细胞高表达血清白蛋白(serum albumin,ALB)、AFP、CY3P4等基因,并表达肝细胞相关性蛋白HepPa r-1、AFP、CK18、CK19.PAS染色显示肝脏样细胞胞质呈红色表现.结论 利用消化离心法在体外成功构建了人原代脂肪干细胞系,可长期存活,反复传代,经诱导后可转化为有功能的肝脏样细胞,为脂肪间充质干细胞作为生物人工肝及肝组织工程的种子细胞提供理论依据.
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LIF基因慢病毒载体构建及其在人脂肪间充质干细胞的表达
目的 构建LIF慢病毒载体,转染人脂肪间充质干细胞,以此获得高表达LIF的人脂肪间充质于细胞,为LIF在人脂肪间充质干细胞介导的免疫调节效应机制研究中奠定基础.方法 以PCR扩增得到LIF基因序列,采用质粒重组技术获得载有LIF基因的重组质粒,然后用重组质粒包装慢病毒.用胶原酶消化法分离培养人脂肪间充质干细胞,然后将慢病毒转染人脂肪间充质干细胞,通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,采用流式细胞技术检测慢病毒转染率,RT-PCR及Western blot技术检测LIF的表达水平,后经SPSS 13.0软件对数据进行统计学分析,计量资料均以((x)±s)表示,组间均数比较采用成对样本t检验,以P＜0.05为差异有统计学意义.结果 通过PCR技术扩增得到LIF基因序列,并且成功构建带有LIF基因的重组质粒,重组质粒经限制性内切酶双酶切鉴定,得到大小为608 bp左右的条带,大小与LIF基因序列匹配,通过重组质粒转染293T细胞后获得慢病毒颗粒,滴度检测达1×108 TU/ml.成功分离得到纯度高的hASCs,慢病毒转染hASCs后,流式细胞仪检测慢病毒转染率可达90％.RT-PCR及Western blot结果经统计学分析提示,转染后LIF的表达水平明显升高.结论 携带人LIF基因的慢病毒载体可以有效转染hASCs,并且表达LIF.
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N-(6-氨乙基)-5-氯-1-萘磺酰胺在体外对人脂肪间充质干细胞转分化为内皮细胞的影响
目的 研究N-(6-氨乙基)-5-氯-1-萘磺酰胺(W7)在体外对人脂肪间充质干细胞(hADSCs)转分化为内皮细胞(EC)的影响.方法 以含40 ng/ml血管内皮生长因子(VEGF)和l0ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的干细胞无血清分化培养基进行细胞培养,分为空白对照组(不含W7的分化培养基)和高(30 μmol/L)、中(20μ-mol/L)、低(10μmol/L)剂量W7组.hADSCs加药8 d后,采用流式细胞术(FCM)检测各组EC von Willebrand 因子(vWF)和血管选择性钙黏素(VE-Cadherin)表型变化,激光共聚焦显微镜检测钙荧光探针(Fluo-3)标记的细胞内[Ca2+];变化;同时将W7处理后的hADSCs种植在Matrigel胶上,观察细胞成血管能力;采用Western blot技术分析不同浓度药物处理8 d后细胞外调节激酶(ERK)和磷酸化ERK(p-ERK)变化.结果 分化至8 d时,与空白对照组相比,hADSCs转分化后的细胞VE-Cadherin和vWF表达量随W7浓度降低而显著上升(P＜0.01),胞质[Ca2+];显著升高(P＜0.01).W7干预组的培养细胞均有管腔样血管结构形成,空白对照组的细胞无血管管型形成.与空白对照组相比,不同剂量W7干预组间细胞的ERK表达水平差异无统计学意义(P＞0.05);随着W7浓度的降低,p-ERK表达水平明显升高(P＜0.05).结论 适当浓度的W7可促进hADSC向EC诱导分化,其机制可能与促进细胞内[Ca2+];增加,激活细胞分化过程中的ERK/MAPK信号通路有关.
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人脂肪间充质干细胞成功诱导分化为脂肪细胞
目的 分离培养人脂肪间充质干细胞(hADSCs),探讨hADSCs生长特性及分化为脂肪细胞的能力.方法 采用I型胶原酶消化和贴壁筛选联合培养方法,从人腹部吸脂术所抽取的脂肪组织中分离培养间充质干细胞,传代,绘制其生长曲线,免疫细胞化学染色检测细胞表面标志物以鉴定所分离细胞;利用三联诱导法诱导人脂肪间充质干细胞向脂肪细胞分化,并进行油红O染色鉴定,显微镜下观察.结果 原代人脂肪源间充质干细胞贴壁生长,为形态相对均一的梭形细胞,呈平行排列生长,生长曲线呈“s”型分布,间充质干细胞相关标志物CD44、CD49d高表达,而CD34、CD106则呈阴性.三联诱导法成功诱导人脂肪源间充质干细胞向脂肪细胞分化,诱导7d后镜下可见脂滴的出现,12d后为显著,油红O染色脂滴着红色.结论 hADSCs经过体外扩增及成脂诱导成功分化为脂肪细胞,可成为组织工程理想种子细胞.
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脂肪间充质干细胞移植上调肝脏增殖细胞核抗原表达促进肝细胞的再生
背景:脂肪间充质干细胞能够改善肝衰竭大鼠肝功能,在组织工程和细胞移植领域具有重要研究价值.目的:通过观察人脂肪间充质干细胞治疗肝衰竭大鼠的疗效,探讨其可能的相关生物学机制.方法:将肝衰竭模型大鼠随机分为模型组、脂肪间充质干细胞组,分别通过尾静脉注射生理盐水或DAPI标记的人脂肪间充质干细胞(3.0×106个).细胞移植后1,3,7 d,生化法检测各组大鼠血清肝功能,细胞移植后3 d,ELISA法检测血清肿瘤坏死因子 α、白细胞介素10水平,苏木精-伊红染色观察肝组织病理学变化,Western blot检测大鼠肝组织内增殖细胞核抗原表达.结果与结论:①人脂肪间充质干细胞经尾静脉途径移植后可迁移至大鼠肝、肺组织;②细胞移植后1,3 d,脂肪间充质干细胞组大鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平较模型组显著降低(P<0.05);③细胞移植后3 d,脂肪间充质干细胞组大鼠血清白细胞介素10、肿瘤坏死因子 α 水平较模型组显著降低(P<0.05);④脂肪间充质干细胞组大鼠肝组织变性、坏死减轻;⑤脂肪间充质干细胞组增殖细胞核抗原蛋白表达较模型组显著上调;⑥结果表明,人脂肪间充质干细胞可明显抑制炎性反应,上调增殖细胞核抗原蛋白表达,促进肝细胞再生及肝功能恢复.
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硫酸软骨素酶联合脂肪间充质干细胞治疗大鼠视网膜变性
背景:有研究发现硫酸软骨素酶降解硫酸软骨素蛋白多糖能够促使视网膜上Müller细胞的移行,但硫酸软骨素酶降解硫酸软骨素蛋白多糖是否能促进脂肪间充质干细胞在视网膜变性大鼠视网膜的移行尚不明确.目的:探讨硫酸软骨素酶降解硫酸软骨素蛋白多糖对脂肪间充质干细胞治疗大鼠视网膜变性的影响.方法:分离并培养人脂肪间充质干细胞,建立视网膜变性大鼠模型,向视网膜变性大鼠视网膜下腔注射脂肪间充质干细胞+硫酸软骨素酶,观察移植后大鼠脂肪间充质干细胞迁移率和视网膜细胞凋亡情况.结果与结论:人脂肪间充质干细胞能够成功培养,BrdU对人脂肪间充质干细胞的标记率达90.0%以上.建模后7 d,视网膜外核层塌陷,光感受器细胞大量外节迸解,外核层贴附在Bruch''s膜上,视网膜呈拱桥样,中央视网膜和外周视网膜均受到损伤;正常大鼠视网膜各层清晰,光感受器细胞排列规律,视网膜色素上皮层完整.脂肪间充质干细胞+硫酸软骨素酶组脂肪间充质干细胞迁移率高于脂肪间充质干细胞组,且2组视网膜细胞凋亡率比较差异无显著性意义.表明硫酸软骨素酶降解硫酸软骨素蛋白多糖可提高人脂肪间充质干细胞在视网膜上的迁移能力.
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高度同源性人脂肪间充质干细胞体外分离培养条件的优化
背景:目前关于人脂肪间充质干细胞有效分离培养及扩增的方法尚未统一.目的:拟在体外建立人脂肪间充质干细胞的有效分离方法.设计、时间及地点:细胞学体外实验,于2008-06/12在吉林大学病理生物学教育部重点实验室完成.材料:手术切除的人腹部脂肪由吉林大学附属医院提供,提供者对实验均知情同意.方法:取腹部脂肪,去除结缔组织和血管,用0.1%Ⅰ型胶原酶37℃振荡消化60 min,过滤后离心,将位于下层的片状沉淀用含体积分数为10%胎牛血清的LG-DMEM条件培养基重悬,调整细胞密度至1×10~9L~(-1)接种于6孔板中,于37℃、体积分数为5%的CO_2孵箱内培养,待细胞接近80%～90%融合时消化传代.取P3代细胞,分别进行成骨及成脂肪诱导.主要观察指标:应用激光扫描共聚焦显微镜观察人脂肪间充质干细胞形态学特点;采用流式细胞仪和免疫荧光法检测其免疫学表型、细胞周期、生长曲线;观察其多向分化潜能.结果:分离培养的人脂肪间充质干细胞为成纤维细胞样,呈漩涡状排列.P3代人脂肪间充质干细胞呈CD73,CD105,CD166,CD44及CD29阳性,而CD31,CD34,CD45及HLA-DR阴性;具有典型的干细胞增殖特点,83.81%细胞处于G_0/G_1期,仅16.19%细胞处于S+G2/M期;细胞在接种后前2 d处于生长潜伏期.第3～6天处于对数生长期,第6天达峰值,以后细胞生长速度减慢,进入生长平台期,平均五六天传代1次.成骨诱导2周后,细胞碱性磷酸酶染色呈阳性;成脂诱导3 d后,细胞内有小脂滴出现,油红O染色呈阳性.结论:分离脂肪组织的过程中去除大体可见的血管与结缔组织可减少细胞污染;胶原酶浓度为0.1%和振荡消化时间为60 min时,可使基质细胞和脂肪基质纤维成分有效分离,以及使胶原酶与组织得到充分接触,从而获得高度同源性的人脂肪间充质干细胞.
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京尼平交联Ⅰ型胶原蛋白材料与人脂肪间充质干细胞的生物相容性
背景：京尼平的低毒性具有一定的种属和细胞特异性，人脂肪间充质干细胞与京尼平交联的Ⅰ型胶原蛋白支架材料的生物相容性对于应用两者构建组织工程脂肪至关重要。
目的：评估人脂肪间充质干细胞与京尼平交联的Ⅰ型胶原蛋白支架材料的生物相容性。
方法：分离培养人脂肪间充质干细胞，传代培养至第3代，接种于京尼平交联的Ⅰ型胶原蛋白支架材料上。MTT法评估人脂肪间充质干细胞在支架材料上的黏附和增殖情况，支架材料对细胞的毒性作用；光镜和电镜分别观察人脂肪间充质干细胞在支架材料上的黏附和生长过程，以及细胞形态学变化。
结果与结论：人脂肪间充质干细胞接种于支架材料后，能够迅速在材料上黏附、增殖，其黏附率平均为86.5%；光镜和扫描电镜显示人脂肪间充质干细胞在支架材料上黏附性良好，随着时间的推移，细胞逐渐增多，可以迁移进入支架内部并均匀分布。结果表明京尼平对细胞的毒性低，交联后的支架材料与人脂肪间充质干细胞具有良好的体外生物相容性。 -
人脂肪间充质干细胞与再生障碍性贫血患者T淋巴细胞的体外共培养
背景：目前已有临床应用造血干细胞联合间充质干细胞输注治疗再生障碍性贫血的报道。目的：观察人脂肪间充质干细胞对再生障碍性贫血T淋巴细胞分泌功能的调节作用。
方法：从健康人脂肪中提取并培养人脂肪间充质干细胞，从再生障碍性贫血患者外周血中分离T淋巴细胞，将两者共培养后，以健康志愿者的T淋巴细胞单独培养及与人脂肪间充质干细胞共培养做对照。ELISA法检测上清白细胞介素2、白细胞介素4、白细胞介素10和γ-干扰素的水平，Realtime RCR和Western blot测定T-bet和GATA-3的表达。
结果与结论：共培养7 d后，间充质干细胞+再生障碍性贫血T淋巴细胞组Th1类细胞因子γ-干扰素、白细胞介素2水平明显低于再生障碍性贫血T淋巴细胞组(P<0.05)，Th2类细胞因子白细胞介素4、白细胞介素10水平明显高于再生障碍性贫血T淋巴细胞组(P<0.05)；间充质干细胞+再生障碍性贫血 T淋巴细胞组T-bet mRNA及蛋白表达水平均低于再生障碍性贫血T淋巴细胞组，GATA-3 mRNA及蛋白水平均高于再生障碍性贫血 T淋巴细胞组。提示人脂肪间充质干细胞在体外对再生障碍性贫血患者T淋巴细胞具有免疫调节作用，其机制可能是通过调节转录因子T-bet和GATA-3的表达从而抑制Th细胞向Th1细胞方向分化。 -
1,25(OH)2D3对脂肪干细胞分泌Ⅰ型胶原的影响及作用机制
背景:脂肪间充质干细胞具有促进创伤修复的作用,但其分泌的Ⅰ型胶原会促进瘢痕形成,因此,寻找抑制脂肪间充质干细胞分泌胶原的方法将进一步增强其应用价值.目的:观察1,25(OH)2D3对脂肪间充质干细胞分泌Ⅰ型胶原的影响及其作用机制.方法:①利用胶原酶消化法分离培养人脂肪间充质干细胞,将第4代脂肪间充质干细胞分别培养在含不同浓度(10-7,10-8,10-9,10-10,0 mol/L)1,25(OH)2D3的DMEM/F12培养基中干预4 d,收集细胞培养上清,采用ELISA方法检测Ⅰ型胶原水平;②选取1,25(OH)2D3抑制Ⅰ型胶原分泌作用明显的浓度对脂肪间充质干细胞进行干预,通过Real-time PCR检测1,25 (OH)2D3干预前后细胞内Smad3的mRNA表达,Western blot检测1,25(OH)2D3干预前后细胞内Smad3总蛋白和磷酸化蛋白表达;③在1,25(OH)2D3干预基础上加入SMAD3抑制剂SIS3对脂肪间充质干细胞进行干预,4 d后收集细胞培养上清,采用ELISA方法检测Ⅰ型胶原水平,以分析Smad3信号通路在其中的作用.结果与结论:①1,25(OH)2D3对人脂肪间充质干细胞分泌Ⅰ型胶原的影响表现为剂量依赖性抑制作用;②Real-time PCR和Western blot结果显示1,25(OH)2D3干预后Smad3表达水平有一定升高;Western blot结果显示磷酸化Smad3蛋白含量显著升高;③Smad3抑制剂可阻断1,25(OH)2D3对Ⅰ型胶原分泌的抑制作用;④这些结果表明,1,25(OH)2D3可能通过上调Smad3的表达及活性来抑制人脂肪间充质干细胞分泌Ⅰ型胶原.
