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基因沉默血管内皮生长因子受体3对胃癌细胞增殖的抑制作用
目的: 探讨靶向血管内皮生长受体-3(vascularendothelial growth factor receptor-3, VEGFR-3)小干扰RNA重组载体对胃癌细胞增殖的作用.方法: 构建pSUPER-shRNA/VEGFR3重组载体, 将其转染入胃癌细胞SGC-7901, 采用MTT法观察细胞的生长曲线, RT-PCR检测重组载体在转染前后VEGFR-3 mRNA表达水平的变化, Western blot检测VEGFR-3的蛋白表达.结果: pSUPER-shRNA/VEGFR3重组载体可显著抑制SGC-7901细胞中VEGFR-3基因的表达( P<0.05); 转染pSUPER-shRNA/VEGFR3的SGC-7901细胞生长明显受抑制( P<0.05),VEGFR-3基因蛋白表达明显降低( P<0.05).结论: pSUPER-shRNA/VEGFR3重组载体能够对胃癌细胞SGC-7901中VEGFR-3形成基因沉默, 并抑制胃癌细胞的增殖.
关键词： 胃癌 RNA干扰 血管内皮生长因子受体-3 细胞增殖 质粒重组 -
LIF基因慢病毒载体构建及其在人脂肪间充质干细胞的表达
目的 构建LIF慢病毒载体,转染人脂肪间充质干细胞,以此获得高表达LIF的人脂肪间充质于细胞,为LIF在人脂肪间充质干细胞介导的免疫调节效应机制研究中奠定基础.方法 以PCR扩增得到LIF基因序列,采用质粒重组技术获得载有LIF基因的重组质粒,然后用重组质粒包装慢病毒.用胶原酶消化法分离培养人脂肪间充质干细胞,然后将慢病毒转染人脂肪间充质干细胞,通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,采用流式细胞技术检测慢病毒转染率,RT-PCR及Western blot技术检测LIF的表达水平,后经SPSS 13.0软件对数据进行统计学分析,计量资料均以((x)±s)表示,组间均数比较采用成对样本t检验,以P＜0.05为差异有统计学意义.结果 通过PCR技术扩增得到LIF基因序列,并且成功构建带有LIF基因的重组质粒,重组质粒经限制性内切酶双酶切鉴定,得到大小为608 bp左右的条带,大小与LIF基因序列匹配,通过重组质粒转染293T细胞后获得慢病毒颗粒,滴度检测达1×108 TU/ml.成功分离得到纯度高的hASCs,慢病毒转染hASCs后,流式细胞仪检测慢病毒转染率可达90％.RT-PCR及Western blot结果经统计学分析提示,转染后LIF的表达水平明显升高.结论 携带人LIF基因的慢病毒载体可以有效转染hASCs,并且表达LIF.
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基于CRISPR/Cas9系统构建精准调控Wnt信号通路的表达载体及其效果的验证
目的:构建基于CRISPR/cas9系统调控Wnt信号通路的载体,并在细胞水平验证其调控基因表达的效率.方法:选取Wnt信号中负性调控分子,设计并合成能够表达靶向上述分子gRNA的互补DNA克隆序列,BsmBI限制性内切酶酶切载体后,采用分子克隆的方法将上述序列克隆至目的载体lenti-sgRNA-Ms2-zeo,测序正确的克隆通过Lipofectamine2000与lenti-Ms2-P65-HSF1-Hygro和lenti-dcas9-VP64-blastine共同转染入293细胞;转染24h后收集细胞,qRt-PCR检测目的基因的表达.结果:筛选了Wnt信号通路中已知的19个负性调控基因;针对每个基因设计了两对gRNA序列,并构建了能够表达gRNA和MS2融合序列的载体,测序结果显示重组质粒的DNA序列与预期完全相符.随机挑选了4个表达载体与lenti-Ms2-P65-HSF1-Hygro和lenti-dcas9-VP64-blastine共转进入细胞,qPCR结果显示构建的目的载体联合lenti-Ms2-P65-HSF1-Hygro和lenti-dcas9-VP64-blastine载体可以协同促进靶分子表达.结论:本研究成功构建了基于CRISPR/cas9基因编辑系统调控Wnt信号的载体.
关键词： CRISPR/Cas9 gRNA 质粒重组 基因表达 Wnt信号通路 -
大鼠骨桥蛋白重组腺病毒的构建及体外表达
目的:构建表达大鼠骨桥蛋白(osteopontin,OPN)基因的重组腺病毒载体,并观察其感染人胚肾293AD(human embryo kidney 293AD,HEK293AD)细胞后OPN的表达.方法:提取大鼠骨组织总RNA,利用反转录聚合酶链式反应(reversal transcript polymerase chain reaction,RT-PCR)扩增目的片段,将产物双酶切后连入腺病毒穿棱质粒载体中,构建pacAd5 CMV-IRES-GFP-OPN.PCR及双酶切鉴定正确后,与腺病毒骨架载体pacAd5 9.2-100同时经Pacl酶切,利用HEK293AD细胞进行包装、生产,构建出重组腺病毒.通过HEK293AD细胞绿色荧光表达反映重组腺病毒的表达情况,并用RT-PCR检测OPN的表达.结果:成功构建了携带OPN的重组质粒,脂质体介导下转染HEK293AD细胞,7d后可见明显的荧光表达,12d后有半数细胞飘起,收集原病毒液感染的293AD 细胞后,实验组OPN的表达明显高于对照组细胞,24h感染效率为15％,36 h感染效率为21％.结论:利用腺病毒载体系统RAPAD成功构建了含OPN基因的重组腺病毒载体,为进一步研究OPN对皮肤创口愈合的影响提供了一定的实验基础.
