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高分辨熔解曲线技术在Wilson病致病基因突变鉴定中的应用
目的 在一个肝豆状核变性(WD)家系中进行致病突变鉴定和产前基因诊断.方法 酚-氯仿法提取外周全血或妊娠13周胎儿绒毛组织基因组DNA;利用PCR-Sanger测序技术对先证者ATP7B基因外显子及外显子/内含子衔接区序列进行突变分析;针对先证者携带的突变位点,应用聚合酶链反应(PCR)-高分辨熔解曲线(HRM)方法对先证者家系4名成员进行突变鉴定,并在此基础上为患儿母亲提供产前基因诊断.结果 先证者ATP7B基因第8外显子存在纯合致病突变c.2333G＞T(p.R778L);该家系5名成员和4名群体正常样本分属于3种不同熔解曲线.HRM分析结果与测序结果一致,即:患儿本人为R778L的纯合子,其父母、姐姐和母亲产前诊断的胎儿均为突变杂合子,4名群体正常对照为纯合野生型.结论 在一个WD家系中检测到ATP7B基因热点突变c.2333G＞T(p.R778L),并针对该突变建立了一种基于PCR-HRM技术的快速突变鉴定方法,成功为家系提供产前基因诊断.
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高分辨熔解曲线分析方法检测子宫肌瘤MED12基因突变
目的 建立高分辨熔解曲线分析(HRMA)检测子宫平滑肌瘤MED12基因突变.方法 针对MED12基因突变位点设计PCR扩增引物,对60例子宫肌瘤标本进行PCR扩增.用HRMA技术对PCR产物进行突变分析,并通过DNA测序技术对HRMA结果进行验证.结果 60例子宫平滑肌瘤样本中,HRMA检出MED12基因突变率为53.3％(33/60),测序法检出突变率为51.7％(31/60),两者比较差异无统计学意义(x2=0.0335,P=0.885).两者符合率为96.7％ (58/60).结论 本研究成功建立HRMA技术检测MED12基因突变,可用于临床子宫肌瘤标本的检测.
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应用高分辨熔解曲线分析方法检测β-地中海贫血纯合突变
目的 探讨高分辨熔解曲线分析方法(HRM)检测β-地中海贫血纯合突变的有效性.方法 应用HRM方法对中国常见的4种β-地中海贫血(4个IVS-Ⅱ-654即HBB:c.316-197C>T,3个Codons 41/42即HBB.c.126-129 delCTTT,1个Codon 17即HBB.c.52A>T和4个-28即HBB:C.-78A>G)纯合突变进行检测,通过直接检测和与野生型标本混合后再检测2种方法检测.结果 HRM方法可以检测出中国常见的4种β-地中海贫血纯合突变.结论 HRM方法可以对ep国常见的4种β-地中海贫血纯合突变进行检测,在产前诊断上有很好的应用前景.
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HRMA技术在检测线粒体DNA单核苷酸多态性中的应用
目的 探索高分辨熔解曲线分析(HRMA)技术在检测线粒体DNA分子基因多态性中的应用.方法 利用未标记探针HRMA技术,进行人线粒体DNA单核苷酸多态性(mtSNPs)分型,并经限制性片段长度多态(RFLP)分型技术和测序验证.结果 未标记探针HRMA分型与RFLP分型和测序验证结果完全相符.结论 本研究表明未标记探针HRMA技术方法准确率较高,是一种适合mtSNPs分型的方法.
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高分辨熔解曲线法检测112例JAK2V617F基因突变及回顾性分析
目的:探讨JAK2V617F基因突变在骨髓增殖性肿瘤(MPN)中的诊断、鉴别诊断和治疗后追踪监测的意义.方法:采用高分辨熔解曲线分析技术(HRM)检测112例患者JAK2V617F基因突变情况,结合临床资料进行回顾性分析.结果:77例确诊MPN中有57例检测到JAK2V617F突变阳性,阳性率74％.其中真性红细胞增多症(Pv)阳性率87.5％(21/24),原发性血小板增多症(ET)阳性率69.77％(30/43),原发性骨髓纤维化(PMF)阳性率60％(6/10).血常规异常而未能诊断MPN的35例样本JAK2V617F突变均为阴性.追踪监测28例经正规治疗后血常规好转并稳定2年的MPN患者JAK2V617F突变情况,19例JAK2V617F突变阳性患者有18例呈持续阳性,有1例转为阴性；9例JAK2V617F突变阴性患者均呈持续阴性.结论:HRM技术检测JAK2V617F突变可用于临床辅助诊断MPN及鉴别继发性血小板或红细胞增高症,并适用于治疗后追踪观察.
关键词： 骨髓增殖性肿瘤 高分辨熔解曲线分析 JAK2V617F基因 -
真菌通用引物结合高分辨熔解曲线分析检测鉴定常见曲霉菌
目的 探索一种能够快速检测鉴定临床常见侵袭性曲霉菌病原的新型分子生物学方法.方法 以真菌核糖体RNA基因的内转录间隔区2为靶基因,在5.8S、28S rRNA基因上设计泛真菌通用引物,扩增临床常见曲霉菌.同时用新生隐球菌基因组DNA、人基因组DNA及临床常见细菌基因组DNA进行引物特异性检测.将通用真菌引物扩增产物进行高分辨熔解曲线分析.以新鲜提取的烟曲霉基因组DNA为模板按照1:10的比例梯度稀释,进行敏感性检测.检测7个浓度梯度的烟曲霉基因组DNA.结果 设计的真菌通用引物可以扩增临床常见的4种曲霉菌及新生隐球菌,但与人基因组DNA和临床常见细菌基因组DNA无扩增反应,检测限可低至1.5 pg/μl,且4种曲霉菌及新生隐球菌扩增产物的熔解曲线不同.该方法敏感性和特异性均较好.结论 利用真菌通用引物的扩增产物结合高分辨熔解曲线分析可以达到检测鉴定临床常见4种曲霉菌的目的,此方法对侵袭性曲霉菌的快速检测鉴定具有重要意义.
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赤道几内亚比奥科岛居民的镰型红细胞病的流行病学调查
目的 了解非洲赤道几内亚比奥科岛(Bioko Island)人群的镰刀形红细胞病(sickle cell disease,SCD)的流行病学特点. 方法 在2013年1月至12月期间,采用红细胞镰变试验对1 036名本岛居民进行筛查.用高分辨熔解曲线(high-resolution melting,HRM)分析和PCR-DNA测序法对筛查阳性的标本进行基因型鉴定. 结果 赤道几内亚比奥科岛居民的SCD发生率为16.99％ (176/1 036).HRM法与PCR-DNA测序法具有较好的一致性(100％). 结论 比奥科岛是SCD高发区,当地政府和卫生部门应采取有效的干预措施来减少这种疾病的危害.HRM法对SCD的鉴定准确性较高.
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G6PD缺乏症基因型检测新方法的建立及分子流行特征分析
目的 建立葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症基因型检测的新方法及深入了解梅县地区大学生G6PD缺乏症的流行特征. 方法 经G6PD酶活性定量测定法确诊为G6PD缺乏症患者,用高分辨率熔解曲线法检测基因突变类型,对所有样本进行DNA测序验证. 结果 G6PD缺乏症的发病率为7.5％.共发现17种不同的基因型,其中常见的2种基因型是G6PD Canton( 1376 G＞T)和G6PD Kaiping( 1388G＞A),占70％以上；接下来的是G6PD Gaohe( 95 A＞G)、G6PD Union( 1360 C＞T)、G6PD Chinese-4( 392 G＞T)、G6PD Chinese-5( 1024 C＞T).此外,5.33％( 4/75)的G6PD缺乏症患者没有发现任何突变.结论 高分率熔解曲线( high-resolution melting,HRM)是一种快速、廉价、有效的G6PD基因型筛查方法.
关键词： 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症 基因突变 高分辨熔解曲线分析 DNA测序 -
高分辨熔解曲线分析正常核型成人AML的NPM1基因突变
目的 研究急性髓细胞白血病(AML)患者核仁磷酸蛋白1(NPM1)基因突变检测方法.方法 应用PCR结合高分辨熔解曲线分析技术(HRM)和毛细管电泳法(CE)检测正常核型的成人AML样本的NPM1基因突变,并与CE法进行比较分析,结果经克隆测序验证.结果 85例AML样本均得到可供分析的NPM1基因突变检测结果,NPM1基因突变阳性19例,其中15例A型突变,4例B型突变,突变阳性率为22.4％.与CE法比较,二者符合率为100.0％(85/85),HRM检测的敏感性和特异性均达到100.0％.结论 应用HRM技术检测NPM1基因突变快速简便,而且敏感,是一项适合临床开展的新方法,可用于临床AML诊断分型、治疗和预后指导.
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高分辨熔解曲线分析慢性骨髓增殖性疾病JAK2V617F基因突变
目的 研究慢性骨髓增殖性疾病(CMPDs)获得性JAK2V617F突变检测方法.方法 应用高分辨熔解曲线分析技术(HRM),对前期经等位基因特异性PCR法(AS-PCR)分析过的36倒CMPDs样本进行JAK2V617F基因突变检测,并与AS-PCR检测情况进行比较分析,结果经测序验证.结果 36例CMPDs样本均得到可供分析的JAK2V617F基因突变HRM检测结果,与AS-PCR法相比较,二者的符合率为97%(35/36);只有一份样本结果不相符,经测序验证,结果与HRM检测相一致;HRM检测的敏感性和特异性均达100%.结论 应用HRM技术检测JAK2V617F突变快速简便、而且敏感,是一项适合临床开展的新方法,可用于临床辅助CMPDs的诊断.
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三个原发性肥大性骨关节病家系HPGD基因突变的鉴定
目的 应用DNA测序和高分辨熔解曲线(high-resolution melting,HRM)分析技术对3个原发性肥大性骨关节病(primary hypertrophic osteoarthropathy,PHO)家系进行HPGD基因的突变分析,了解中国PHO患者可能的热点突变.方法 PCR扩增HPGD基因的全部外显子及外显子/内含子衔接区,并对PCR产物进行测序;针对先证者候选突变位点,通过HRM完成家系验证,并进一步通过基因测序技术对HRM方法的准确性进行鉴定.结果 3例PHO先证者均存在HPGD基因第3外显子c.310_311delCT (p.L104Afs*3)突变,其中2例为纯合子,1例为杂合子.对先证者和家系成员及正常对照样本的HRM分析结果显示3种不同的曲线型,经测序验证表明3种曲线分别为野生型与突变c.310_311delCT的杂合子和纯合子.结论 c.310_311delCT(p.L104Afs*3)很可能是中国PHO患者的基因突变热点,HRM分析检测HPGD基因突变具有方便快捷、灵敏特异的优点,可作为PHO患者及携带者突变筛查HPGD基因突变的优选方法.
关键词： 原发性肥大性骨关节病 HPGD基因 基因突变 高分辨熔解曲线分析 -
一个角膜炎-鱼鳞病-耳聋综合征家系的致病突变分析
目的 对1例角膜炎-鱼鳞病-耳聋综合征患者进行GJB2基因的突变鉴定,并在此基础上完成家系突变验证和突变起源分析.方法 通过酚氯仿法提取基因组DNA;应用PCR Sanger测序鉴定先证者GJB2基因外显子及外显子/内含子衔接区序列;针对先证者携带的突变位点,应用PCR-高分辨熔解曲线(high resolution melting,HRM)方法进行家系突变验证;利用T-克隆测序技术进一步确定突变的亲本来源.结果 在先证者GJB2基因的第2外显子检测到1个c.148G＞A (p.Asp50Asn)杂合错义突变,HRM分析结果与测序结果一致;克隆测序显示患儿致病突变源自父亲生殖细胞突变.结论 在1个中国人角膜炎-鱼鳞病-耳聋综合征家系检测到GJB2基因热点突变c.148G＞A,并针对该突变建立一种基于PCR-HRM技术快速鉴定突变的方法;此方法方便、快捷,可作为该病患者突变筛查的优选方法.
关键词： 角膜炎-鱼鳞病-耳聋综合征 GJB2基因 高分辨熔解曲线分析 基因突变 -
应用PCR-HRM技术进行FGFR3热点突变的快速诊断
目的 在5个软骨发育异常家系中进行致病突变检测,并在明确突变的基础上建立针对热点致病突变的快速检测方法.方法 酚-氯仿法提取先证者及家系成员外周血基因组DNA;用PCR-Sanger测序技术对5例先证者的FGFR3基因外显子及外显子/内含子衔接区序列进行突变分析;继而针对突变热点建立高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM)检测方法.结果 经直接测序确认4例先证者存在FGFR3基因第8外显子的c.1138G＞A(p.Gly380Arg)杂合突变,另外1例先证者存在FGFR3基因第11外显子内的c.1620C＞G(p.Asn540Lys)杂合突变;所有5例先证者HRM分析结果与测序结果一致.并对家系中胎儿进行了产前基因诊断.结论 FGFR3基因的Gly380Arg和Asn540Lys突变是软骨发育不全/不良相关热点致病突变,在明确患者致病突变的基础上建立的基于PCR-HRM的突变热点的快速基因诊断方法,为该病的快速产前基因诊断奠定了方法学基础.
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成骨不全患儿COL1A1基因第45外显子两个突变位点的筛查及分析
目的 应用聚合酶链反应-高分辨率熔解曲线分析(polymease chain reaction-high-resolution melting analysis,PCR-HRMA)技术筛查成骨不全症(osteogenesis imperfecta,OI)患者COL1A1/COL1 A2基因的突变,并探讨突变位点与疾病的关系.方法 采集家系成员(患儿、患儿父母)以及50名正常对照的血液样本,应用PCR-HRMA技术筛查患儿家系及正常对照者的COL1A1/COL1A2基因突变,并用基因测序验证.应用蛋白预测软件PolyPhen、SIFT及Align GVGD对两个杂合突变进行预测.结果 该患儿及其父母COL1A1基因第45外显子区域的PCR-HRMA结果显示异常,标准熔解曲线和差异熔解曲线与正常对照比较均存在明显差异.测序结果显示,患儿COL1A1基因第45外显子区域发生两个杂合突变(c.3235G＞A、c.3247G＞A),临床诊断为Ⅳ型OI.c.3235G＞A来源于患有OI的父亲,使α螺旋结构域1079位氨基酸由甘氨酸(Gly)突变为丝氨酸(Ser).c.3247G＞A来源于表型正常的母亲,使1083位氨基酸由丙氨酸(Ala)突变为苏氨酸(Thr).50名正常对照均未发现这两种突变.3种蛋白预测软件PolyPhen、SIFT及Align GVGD均预测c.3235G＞A突变可能影响蛋白的功能.而c.3247G＞A突变,PolyPhen软件预测其可能为良性.结论 COL1A1基因第45外显子上同时存在c.3235G＞A、c.3247G＞A突变的病例在人类胶原突变数据库中未见报道.COL1A1基因c.3235G＞A突变可能是导致该患儿成骨不全的主要原因.
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应用高分辨熔解曲线技术检测中国人Wilson病的常见基因突变
目的 应用PCR-高分辨熔解曲线分析技术检测中国人Wilson病(Wilson disease,WD)患者中ATP7B基因内高频突变区第8和13外显子.方法 酚-氯仿法提取外周全血基因组DNA;PCR扩增患者ATP7B基因第8和13外显子及两个外显子中的突变热点区域,PCR产物经HR-1进行高分辨熔解曲线分析;进一步以限制性内切酶或(和)DNA测序法对高分辨熔解曲线检测结果进行验证.结果 在30例WD患者中,检测到R778L纯合子3例,R778L杂合子6例,P992L杂合子6例,P992D/S975Y的复合杂合子1例,R778L/P992L复合杂合子2例和R778L/752.33delG复合杂合子1例.本组样本中,R778L、P992L和S975Y的基因频率分别为25%、15%和1.67%.测序及限制性内切酶分析结果完全与高分辨熔解曲线分析结果一致.结论 高分辨熔解曲线分析检测ATP7B基因突变具有简便、快速、特异和灵敏等优点,可作为Wilson病患者及携带者突变筛查的优选方法.
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高分辨熔解曲线技术检测阴道念珠菌分型的研究
目的 探讨采用高分辨熔解曲线方法鉴定常见致病性念珠菌的可行性,为外阴阴道念珠菌病的分子流行病学及病原学研究奠定基础.方法 用芽管试验、厚壁孢子试验、科玛嘉(CHROMagar)显色培养基及API20C AUX酵母菌鉴定系统对临床致病性念珠菌进行鉴定,然后对5株标准株和80株临床分离株的基因组DNA内转录间隔区进行聚合酶链反应,对扩增产物进行高分辨熔解曲线分型.结果 5株念珠菌标准株和80株临床株聚合酶链反应扩增后,通过熔解曲线技术分析产生5种不同的峰图,即得到念珠菌5种分型.结论 外阴阴道念珠菌的主要致病菌是白念珠菌(77.50％),高分辨熔解曲线方法鉴定常见的致病性念珠菌特异性强、稳定性好,是传统鉴别方法的有益补充.
