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RegⅠ在胃泌素促胃癌细胞体外增殖通路中的作用
目的 探讨再生蛋白I (RegⅠ)在胃泌素刺激胃癌细胞增殖通路中的作用.方法 根据RegⅠ cDNA已知序列,在线设计3个小干扰RNA,并经基因库同源性比较,构建其RegⅠ-shRNA表达载体(pSUPER-EGFP-REG/1、pSUPER-EGFP-REG/2和pSUPER-EGFP-REG/3),利用脂质体2000转染试剂分别转染胃癌细胞BGC823细胞株、SGC7901细胞株,同时设转染空质粒的实验对照组和无质粒转染的空白细胞组.后经G418筛选建立稳定转染细胞株.RT-PCR检测RegⅠ基因mRNA的转录水平,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测胃泌素孵育对胃癌细胞增殖的效应.结果 酶切及测序鉴定,插入片段正确,3个RegⅠ-shRNA表达载体构建成功;RT-PCR显示,pSUPER-EGFP-REG/1可有效抑制RegⅠ mRNA在胃癌细胞BGC823、SGC7901的转录.Western boltting结果显示,BGC823和SGC7901细胞的RegⅠ蛋白表达率分别下调到空载体对照组的(45±4)%和(53±4)%;MTT结果显示,RegⅠ基因表达抑制胃癌细胞系的增殖效率均降低(P＜0.05).胃泌素孵育后,胃癌细胞BGC823、SGC7901的增殖效率均增加(P＜0.05),而RegⅠ基因表达抑制的胃癌细胞系增殖效率则无明显改变(P＞0.05).结论 实验成功建立了RegⅠ基因表达抑制的胃癌细胞系; RegⅠ基因可能对胃泌素促胃癌细胞的增殖有促进的作用.
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胃泌素对胃癌细胞SGC7901 Reg Ⅰ基因转录因子的效应
目的 探讨胃泌素对胃癌细胞SGC7901 Reg Ⅰ(Reg Ⅰ)基因转录因子的效应.方法 应用巢式PCR技术从胃癌细胞SGC7901基因组DNA扩增Reg Ⅰ基因启动子1414bp片段,将该片段插入pMD19-T载体,序列分析鉴定.应用随机引物法以地高辛分别标记1414bp及其HindⅢ酶切800bp和614bp片段,经灵敏度检测后,作为探针.应用Genomatix MatInspector在线分析软件分析Reg Ⅰ基因启动子1414bp片段的转录因子结合位点.分别以10-7 mol/L和10-8mol/L胃泌素G-17处理胃癌细胞SGC7901 48h,提取核蛋白.应用DNA-蛋白质印迹法(Southern blotting),分别以地高辛标记的1414bp、800bp和614bp片段为探针检测胃泌素对胃癌细胞SGC7901 Reg Ⅰ基因转录因子的效应.结果 1414bp探针可检测到20条蛋白主带.胃泌素孵育后,带型没有变化,但是一些条带的灰度值改变,带9、12、13、14、15和16的灰度值明显降低(P＜0.05)；不同浓度胃泌素处理组之间上述6个条带的灰度值差异不明显(P＞0.05).614bp探针可检测到灰度值变化的6条主带中的带9、12和13,胃泌素处理后,此3条主带的灰度值明显降低(P＜0.05).800bp探针可检测到灰度值变化的6条主带中的带9、12和14,胃泌素处理后,仅带14的灰度值明显降低(P＜0.05).614bp和800bp探针均未检出带15和带16.结论 胃癌细胞SGC7901Reg Ⅰ基因表达由多个转录因子协同调控.降低几个转录因子的结合活性可能是胃泌素上调胃癌细胞SGC7901Reg Ⅰ基因表达的途径之一.
关键词： Reg Ⅰ基因 胃泌素 转录因子 胃癌细胞 DNA-蛋白质印迹法
