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HCV免疫学诊断抗原与链亲和素融合蛋白的制备及应用研究
目的 制备带有链亲和素(SA)标签的丙型肝炎病毒(HCV)融合蛋白,并初步探讨其在抗-HCV ELISA检测中的应用.方法 构建了HCV诊断抗原与链亲和素融合蛋白重组表达质粒pET-11d-C44P-SA,在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,并用Western Blot进行鉴定,表达的融合蛋白经镍金属螯合(Ni-NTA)层析柱进行纯化,透析复性后分别包被生物素化以及普通酶联板,进行人血清抗-HCV检测.结果 成功构建了带有SA标签的重组表达质粒,其在大肠埃希菌BL21(DE3)中实现高效表达,制备的融合蛋白纯度可达90%以上.建立ELISA法进行人血清抗-HCV检测显示:融合蛋白包被生物素化酶联板检测灵敏度与特异性明显高于普通酶联板.结论 构建的融合蛋白作为包被抗原,结合利用SA标签与生物素化酶联板,明显提高了抗-HCV检出的灵敏度与特异性,该策略为进一步提高抗-HCV检测试剂的质量打下了基础.
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鼻咽癌血清学检测方法的改进
目的 改进现有鼻咽癌血清学早期诊断方法,提高检测灵敏度.方法 用链霉亲和素.生物素放大免疫酶法与既有常规免疫酶法对鼻咽癌防治示范基地所取294份普查血清IgA/VCA,IgA/EA抗体进行血清学检测,并用SPSS统计软件对检测结果进行χ2检验和t检验.结果 共检测30岁以上294份普查人群血清,其中鼻咽癌患者血清106份,健康人血清188份.改进的链霉亲和素一生物素放大免疫酶法与既往已有的免疫酶法相比,血清IgA/VCA、IgA/EA抗体的检测阳性率增加;检测血清抗体的几何平均数明显提高.结论 改进方法可以提高血清学检测的灵敏度,同时保证了检测结果的特异性,提高了鼻咽癌的检出率,可以应用于鼻咽癌早期筛查工作.
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胃癌前病变p21ras,c-erbB-2,P53表达与中医证候的关系
目的:观察胃癌癌前病变p21ras,c-erbB-2,p53癌基因蛋白表达与中医证候的关系.方法:经胃镜及病理证实为胃癌癌前病变的病例共40例,其中中度异型增生24例,重度异型增生9例,不完全性结肠化生7例;中医辨证属脾胃气阴两虚兼气滞者10例,兼胃热者12例,兼血瘀者18例.所有胃黏膜活检标本采用抗生蛋白链菌素-生物素免疫组织化学标记的方法作p21ras、c-erbB-2、p53表达的检测.结果:p21ras,c-erbB-2,p53在胃癌癌前病变中有过表达,且其表达随着病变的进展而升高,但中、重度异型增生及不完全性结肠上皮化生胃黏膜之间的表达差异无显著性(P＞0.05).在不同的兼证中,p21ras,p53的表达兼血瘀者大于兼胃热、气滞者(P＜0.01),c-erbB-2的表达兼血瘀、胃热者大于兼气滞者(P＜0.05).结论:p21ras,c-erbB-2,p53癌基因蛋白在胃癌癌前病变中有过表达,其表达与不同中医兼证有关,可能有一定的证候特异性.
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具有细胞穿透功能的串联亲和层析分离载体的构建与功能鉴定
目的 建立基于抗生蛋白链菌素结合肽(SBP)-钙调蛋白结合肽(CBP)分离标签以及细胞穿透肽转录反式激活因子(TAT)和绿色荧光蛋白(GFP)原核表达系统的、具有细胞穿透功能的原核串联亲和层析分离系统.方法 应用PCR方法,以pEG-FP-C2载体为模板扩增EGFP序列,以pNTAP载体为模板扩增CBP-SBP序列,采用退火方法得到TAT片段,采用常规酶切、连接方法将EGFP、CBP-SBP和TAT片段依次克隆入pET14b-MCStop载体中,酶切、PCR和测序鉴定无误后,得到pET14b-CBP-SBP-EGFP-TAT重组质粒.将重组质粒转化BL21(DE3)大肠埃希菌,以IPTG诱导融合蛋白表达,利用Ni2+-NTA亲和层析纯化获得融合蛋白,将不同浓度的融合蛋白加入培养的人肝癌细胞株(HepG2)检测融合蛋白的穿细胞膜功能.结果 所构建的pET14b-MCS-CBP-SBP-EGFP-TAT融合蛋白表达载体正确,该载体可在大肠埃希菌内高效表达,用Ni2+-NTA纯化获得了相对分子量约40kD的目的 融合蛋白.细胞功能实验结果表明融合蛋白能够穿越细胞膜,且具有浓度依赖性.结论 成功构建了pET14b-MCS-CBP-SBP-EGFP-TAT融合蛋白表达载体,并获得了具有良好穿透真核细胞膜功能的融合蛋白,为进一步研究细胞内蛋白相互作用、细胞穿透肽TAT的功能及其穿透细胞的机制奠定了基础.
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乙酰肝素酶生物素-链亲和素系统时间分辨荧光免疫分析法的建立及应用
目的 建立测定乙酰肝素酶(HPA)的生物素-链亲和素系统(BSA) TRFIA并进行初步应用.方法 采用部分基因重组的鼠抗人HPA单克隆抗体包被微孔板条,加入HPA标准品和生物素标记的HPA,两者竞争性结合HPA单克隆抗体,再利用铕标记链亲和素(Eu3+-SA)作为示踪物,建立竞争法BSA-TRFIA.利用该方法检测健康人血清样本(n=32)和肿瘤患者血清样本(n=54)HPA水平,并比较TRFIA结果与ELISA结果的相关性.数据分析采用两样本t检验或t’检验、直线相关分析.结果 该法测定HPA的灵敏度为0.33 iug/L,批内和批间CV分别为5.29%和7.54%,平均回收率为105.5%,标准曲线范围为O-1 000 txg/L.健康人血清样本测定结果为(2.03±1.47)p.g/L,患者血清样本为(22.13_+7.38) tg/L(t’=19.388.P
