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大鼠β防御素2基因慢病毒载体的构建及功能检测
目的 构建大鼠β防御素2(rBD2)基因慢病毒表达载体,并转染培养细胞检测其表达,为rBD2研究及大鼠体内实验奠定基础.方法 提取大鼠上皮细胞总RNA,PCR扩增获得rBD2基因,双酶切PCR产物和慢病毒载体Lentivirus[含H1启动子和绿色荧光蛋白(GFP)],连接构成rBD2基因慢病毒表达载体LV-rBD2,行测序鉴定.用慢病毒包装系统对LV-rBD2进行慢病毒颗粒包装并梯度稀释法测定病毒滴度,病毒液感染培养细胞,RT-PCR和Western Blot检测rBD2表达.结果 凝胶电泳和测序结果表明rBD2基因克隆到慢病毒载体中,序列正确.完成慢病毒颗粒包装,调整病毒滴度至1×105ifu/μl.RT-PCR和Western-Blot显示rBD2基因获得表达.结论 rBD2基因慢病毒表达载体LV-rBD2被成功构建,能转染细胞并获得有效表达.
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阴道上皮细胞转染抗菌肽LL-37和防御素5后对假丝酵母菌的抑制作用
目的 研究人阴道上皮细胞转染抗菌肽LL-37和防御素5(HD5)真核重组质粒后对假丝酵母菌的抑制作用及其分泌白细胞介素8(IL-8)水平的变化.方法 原代培养阴道上皮细胞并传代后,分为无菌组和带菌组,每组内再分别转染LL-37质粒pcDNA3.1(+)/LL-37-EGFP、HD5质粒pcDNA3.1(+)/HD5-EGFP及联合转染两种质粒,并设未转染质粒的阴道上皮细胞为对照；带菌组均与假丝酵母菌共培养.于6、12、24、48 h分别收集培养上清液,ELISA方法检测LL-37、HD5及IL-8的水平；采用葡萄糖消耗法检测各组细胞对假丝酵母菌的抑菌效果(以吸光度值表示).结果 (1)各时段检测结果显示,转染质粒的各组细胞分泌LL-37、HD5、IL-8的水平在转染24h时达高峰,然后呈下降趋势,其中带菌组中联合转染细胞分泌LL-37、HD5、IL-8的水平均高于其他细胞,峰值分别为( 100.16±0.81) ng/ml、(58.50±2.08) μg/ml和(101.03±1.59) pg/ml,差异均有统计学意义(P＜0.01).(2)各时段抑菌效果比较显示,无菌组内各细胞的吸光度值比较,差异无统计学意义(P＞0.05),吸光度值呈缓慢下降趋势,其中,联合转染细胞6、12、24、48 h的吸光度值分别为3.610±0.010、3.590±0.010、3.560±0.010、3.530±0.010(P ＞0.05)；带菌组中联合转染细胞吸光度值6、12、24、48 h分别为3.210±0.010、3.150±0.030、3.099±0.030、2.970±0.040,明显高于组内其他细胞,差异有统计学意义(P＜0.01),且下降趋势较其他细胞缓慢.结论 阴道上皮细胞转染LL-37及HD5质粒后抵抗假丝酵母菌的能力增强,LL-37和HD5可诱导炎症趋化因子IL-8的分泌.
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外阴阴道假丝酵母菌病患者阴道人类防御素分泌及发病相关因素的研究
目的 通过对外阴阴道假丝酵母菌病(VVC)患者与健康妇女的比较,对VVC发病的相关因素进行分析,并研究VVC患者的阴道局部免疫状态.方法 应用病例对照研究方法,对VVC患者(VVC组,60例)及无VVC妇女(正常对照组,60例)进行比较,研究对象均填写调查表,取阴道分泌物进行阴道分泌物常规检查、pH值检测及细菌培养,用酶联免疫吸附试验对阴道冲洗液进行相关细胞因子[白细胞介素2、白细胞介素4、人类防御素5、人类β防御素(HBD)1、HBD2等]含量的检测分析.结果 (1)两组妇女的学历、对妇科感染的了解程度、妇科炎症病史、卫生习惯、性生活情况、药物应用情况比较,差异均无统计学意义(P>0.05);正常对照组慢性宫颈炎的发生率(43%,26/60)高于VVC组(22%,13/60),两组比较,差异有统计学意义(P<0.05).(2)正常对照组与VVC组妇女阴道pH值比较,差异无统计学意义(P>0.05).(3)VVC组妇女阴道分泌物检出假丝酵母菌43例,检出率为72%(43/60).(4)VVC组妇女阴道冲洗液中,人类防御素5、HBDI、HBD2含量[分别为(0.94±0.44)mg/L、(3.1±0.4)μg/L、(10±6)μg/L]明显高于正常对照组[分别为(0.61±0.27)mg/L、(2.7±0.4)μg/L、(7±3)μg/L],分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 VVC是女性常见的外阴阴道炎症,在育龄期妇女VVC的发生与学历、对妇科感染的了解程度、妇科炎症病史、卫生习惯、性生活情况、药物应用情况无明显相关性.人类防御素的作用可能与VVC的发病密切相关.
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阴道上皮细胞先天性抗假丝酵母菌的作用研究
目的:以人阴道上皮细胞和人阴道灌洗液为模型,分析与阴道上皮细胞先天性抗假丝酵母菌机制有关的细胞因子在假丝酵母菌感染中的变化,研究阴道上皮对抗外阴阴道假丝酵母菌病(vulvovaginal candidiasis, VVC)的作用.方法:用组织块法和含表皮生长因子的无血清培养基体外培养人阴道上皮原代细胞,实验组(VVC组)为细胞传代后与培养白假丝酵母菌的上清液共同培养,对照组为传代细胞加无血清培养基,在0、3、6、12、24、48 h收集各组的细胞上清液,用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定阴道上皮细胞分泌的人β防御素-1(human β defensin-1, HBD-1)、人β防御素-2(human β defensin-1, HBD-2)、表面活性蛋白A(surfactant protein-A, SP-A)等细胞因子的变化,并取VVC患者、复发性VVC(RVVC)患者及健康者的阴道灌洗液用ELISA方法分别测定SP-A变化,对实验数据进行统计学分析.结果:在培养的人阴道上皮细胞模型组中,VVC组的HBD-1 (F=62.784,P=0.001)、HBD-2(F=5127.984, P=0.000)和SP-A (F=542.210, P=0.000)的表达均明显高于对照组.在人阴道灌洗液模型组中,VVC组的SP-A明显高于对照组(P=0.021),RVVC组的SP-A高于对照组及VVC组.结论:人阴道上皮细胞有先天性抗白假丝酵母菌作用,能分泌HBD-1、HBD-2、SP-A.白假丝酵母菌感染人阴道上皮细胞时,HBD-1、HBD-2、SP-A的分泌量均有增加.RVVC组的SP-A水平可能比VVC组更高.
关键词： 念珠菌病 外阴阴道 防御素类 肺表面活性物质相关蛋白质A -
慢病毒构建表达人β-防御素3的滑膜间质干细胞及其抑菌活性鉴定
目的 检测利用慢病毒介导人β-防御素3 (humanβ-defensin 3,hβD-3)基因转染人滑膜间质干细胞(synovium-derived mesenchymal stem cells,SMSCs)的安全性及体外抗菌活性.方法 通过膝关节镜手术获取人膝关节交叉韧带及滑膜组织以分离、培养SMSCs,贴块法培养并用磁珠分选仪纯化,通过显微镜观察、免疫荧光鉴定和细胞表面标记对细胞进行鉴定.通过成脂、成骨和成软骨分化诱导分别对细胞多向分化潜能进行测定.利用质粒构建包含hβD-3基因的慢病毒载体并转染SMSCs,绘制细胞生长曲线,采用流式细胞仪确定其DNA含量,使用NOD/SCID小鼠验证其致瘤性.使用琼脂扩散法对转染后的SMSCs进行抑菌活性检测,同时用兔膝关节内金黄色葡萄球菌感染模型验证其体内抑菌作用.结果 贴块法获得的SMSCs经分离纯化后表现出间质干细胞应有的结构和表面标志物,具有多向分化潜能.免疫荧光证实被慢病毒转染的SMSCs能稳定表达hβD-3蛋白.增殖动力学、核型分析、致瘤型分析等证实转染后的SMSCs安全.重组细胞体外和动物模型体内抑菌活性检测显示,传代后的SMSCs(采用P5代细胞)能稳定表达hβD-3并具有抗菌活性.与阴性、阳性对照组比较,低浓度组有一定的抑菌活性,并且随浓度增高,抑菌圈逐渐增大.结论 经重组慢病毒载体感染的人SMSCs能安全稳定地传代并表达hβD-3,体外具有明显的抗菌活性.
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防御素5和LL37真核重组质粒构建及转染人阴道上皮细胞的研究
目的:构建防御素5(HD5)和LL37的真核重组质粒并瞬时转染人阴道上皮细胞,以期探讨阴道上皮细胞抵抗微生物感染的机制.方法:(1)从人阴道上皮细胞中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出HD5和LL37的cDNA,并将其插入真核表达载体pcDNA3.1 (+)-EGFP中、构建重组质粒pcDNA3.1 (+)/HD5-EGFP和pcDNA3.1(+ )/LL37-EGFP.(2)经组织块法原代培养入阴道上皮细胞并传代,将2种质粒分别或联合转染人阴道上皮细胞,转染6、12、24和48 h后,采用荧光显微镜检测细胞转染情况,ELISA方法测定细胞培养上清液中HD5及LL37的表达情况.结果:成功构建了pcDNA3.1( +)/HD5-EGFP和pc DN A3.1(+ )/LL37-EGFP真核表达载体,实现了HD5和LL37在阴道上皮细胞中表达,细胞培养上清中有HD5和LL37蛋白分子表达,且在转染24h时表达量高.联合转染组的HD5和LL37水平高于单独转染组,单独转染组高于未转染组,差异均有统计学意义(均P＜0.001).LL37组和联合转染组的LL37水平,联合转染组的HD5水平均是6h时分泌低,24h达高峰,然后呈下降趋势.HD5组的HD5水平随时间增加而呈增加趋势.结论:HD5和LL37成功转染人人阴道上皮细胞并成功表达,为研究重组HD5和LL37的抗菌功能及阴道上皮细胞先天免疫机制奠定了基础.
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外阴阴道假丝酵母菌病与抗菌肽LL-37及防御素5的关系
目的:探讨外阴阴道假丝酵母菌病(VVC)及复发性VVC(RVVC)患者阴道分泌物中抗菌肽LL-37和防御素5(HD-5)的表达及意义.方法:收集VVC患者31例、RVVC患者27例及对照组30例,应用科玛嘉念珠菌显色培养基筛选出白假丝酵母菌感染患者,采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定其阴道分泌物中抗菌肽LL-37及HD-5的含量.结果:VVC组LL-37、HD-5水平较对照组均升高,RVVC组LL-37水平较对照组升高,差异有统计学意义(P＜0.05)；RVVC组HD-5水平与对照组差异无统计学意义(P＞0.05)；VVC组LL-37、HD-5水平与RVVC组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论:抗菌肽LL-37与VVC发病及RVVC反复发作有关；HD-5与VVC发病有关,但与RVVC 复发的关系尚不确切.
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人源性防御素HD-5的原核表达及抗真菌作用的初步研究
目的：构建pQE-30Xa/HD-5原核表达载体，纯化重组蛋白并进行抗真菌活性的初步鉴定。方法以pcDNA3.1(+)/HD-5为模板，聚合酶链反应（PCR）扩增编码HD-5成熟肽的基因。构建pQE-30Xa/HD-5重组表达载体，并对重组质粒进行酶切、基因序列分析。将鉴定正确的质粒转化入大肠杆菌M15后进行异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，对表达产物进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定。通过镍柱亲和层析纯化蛋白并进行蛋白复性，蛋白免疫印迹（Western blot）鉴定纯化产物。以KB纸片法初步验证纯化获得的重组蛋白对白色假丝酵母菌的抑菌活性。结果成功克隆了HD-5基因并构建了重组质粒pQE-30Xa/HD-5。重组质粒在大肠杆菌M15中诱导表达出HD-5融合蛋白；Western blot分析结果显示纯化后的融合蛋白与目的蛋白相符；KB纸片法证实纯化后的融合蛋白对白色假丝酵母菌具有一定的抑菌活性。结论成功构建HD-5原核表达载体，经诱导表达后纯化获得具有良好抑菌活性的HD-5融合蛋白。
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重组β-防御素-2对呼吸道绿脓杆菌感染大鼠急性肺损伤的保护作用
目的观察重组β-防御素-2对呼吸道绿脓杆菌感染大鼠急性肺损伤(ALl)的保护作用.方法10只清洁级雄性成年SD大鼠,随机分为防御素组和对照组,每组5只.防御素组大鼠暴露声门后,气管内滴注5×107PFU/ml重组腺病毒(含有β-防御素-2编码基因)50 μl,对照组给予等量对照腺病毒(不含β-防御素-2编码基因).48 h后两组气管内滴注6×108CFU/ml绿脓杆菌ATCC27853 200μl,制备绿脓杆菌感染致ALI模型.气管内滴注绿脓杆菌24 h后处死大鼠,采集肺泡灌洗液,进行绿脓杆菌菌落数和白细胞计数;观察肺组织病理学变化,并测定肺组织细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达水平.结果与对照组比较,防御素组BALF中绿脓杆菌菌落数、白细胞计数、肺组织ICAM-1表达水平及肺病理组织学评分降低(P＜0.05).结论重组β-防御素-2对呼吸道绿脓杆菌感染大鼠ALI有一定的保护作用,可能与其杀菌作用和下调肺组织ICAM-1的表达有关.
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益生菌对肠黏膜屏障的作用机制
肠黏膜屏障是指正常肠道具有的将肠腔内物质与机体内环境隔离,防御外来抗原及致病性病原体侵入黏膜下层组织的功能,维持机体内环境的相对稳定和机体的正常生命活动.肠黏膜屏障功能的损伤与多种胃肠道疾病的发生密切相关.益生菌是指摄取后在肠道达到一定数量能够对宿主起有益作用的活微生物,它能够改善或预防多种胃肠道疾病,其主要机制为益生菌能够通过多种途径维持肠黏膜屏障功能.该文就益生菌对肠黏膜屏障功能的具体作用机制作一综述.
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溃疡性结肠炎中防御素、一氧化氮和丙二醛的表达
背景:溃疡性结肠炎(UC)是一种慢性非特异性肠道炎症性疾病,其病因尚不明确.近年来,防御素家族在先天免疫中的作用受到广泛关注.目的:研究UC患者结肠组织中中性粒细胞防御素人中性粒细胞肽(HNP)1-3与一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)的相关性,了解三者在UC发病中的作用.方法:以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测16例活动期UC患者结肠组织和10例正常结肠组织中HNP1-3mRNA的表达,分别以硝酸还原酶法和硫代巴比妥酸(TBA)显色法检测结肠组织NO和MDA水平.结果:UC患者结肠组织HNP1-3 mRNA和NO、MDA的表达水平显著高于正常对照组(P＜0.01),其中UC受累黏膜又显著高于未受累黏膜(P＜0.01).UC受累黏膜中HNP1-3mRNA与NO、MDA的表达具有显著相关性(rs1=0.643,P＜0.01;rs1=0.831,P＜0.01).结论:HNP1-3可能参与了UC结肠组织的炎症损伤过程,NO和MDA可能与HNP1-3协同发挥作用.
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Paneth 细胞与炎症性肠病
Paneth 细胞是一种分布于肠腺底部的肠黏膜分化上皮细胞,可向腺体分泌生长因子和抗微生物肽如溶菌酶和防御素.随着对炎症性肠病(IBD)发病机制研究的不断深入,已发现Paneth细胞及其分泌的抗微生物分子参与了肠道黏膜屏障的破坏,可致自身免疫失衡,启动肠道炎症反应,从而引起肠道黏膜功能的改变,在IBD的触发和复发中起一定作用.Paneth细胞在IBD中是参与免疫防御还是促进免疫损伤,目前仍在研究讨论中.
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雄性大鼠生殖系统中发现的一种抗菌肽基因
Li P,Chan HC,He B et al.An Antimicrobial Peptide Gene Found in the MaleReproductive System of Rats. Science,2001,291(5509):1783～1785.生殖道感染是全球性的公共卫生问题,人们对雄性生殖道天然的宿主防御机制仍然知之甚少.中科院分子生物学国家重点实验室的研究人员采用mRNA差异显示技术,从大鼠附睾中克隆出一条cDNA片段,命名为Bin1b,全长385bp,ORF为204bp,编码一条68个氨基酸的多肽(包括16个氨基酸的信号肽).Northern blot和原位杂交证实Bin1b特异性表达于大鼠的附睾头部,与精子的成熟、贮存和防御有关.这条多肽的结构和抗微生物活性与阳离子抗菌肽β-防御素类似,其表达在大鼠性成熟时高,且能被感染上调.Bin1b似乎是一种天然的附睾特异性抗菌肽,在生殖道宿主防御和雄性生育中具有重要作用.(朱培元摘译,黄宇烽审校)
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分枝杆菌相关抗菌肽的研究进展
分枝杆菌是一类可能引起人体严重感染的病原体,随着分枝杆菌耐药菌株不断增多并在世界范围内传播,对开发新型抗分枝杆菌药物的需求愈发迫切.抗菌肽是一类普遍存在于生物体内、通常为双亲性阳离子结构的肽类物质,其可通过细胞膜破坏机制杀菌,具有广谱抗菌活性.抗菌肽具有来源广泛、抗菌谱广、杀菌迅速、耐药性低等优势.另外,不同于传统抗生素,抗菌肽还可通过穿膜后与细胞内靶点结合,触发下游的免疫学效应.尽管抗菌肽尚处于研发阶段,却已展现出广阔的应用前景.
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抗菌肽与皮肤屏障功能
抗菌肽作为皮肤的重要组成部分,有着广泛的抗微生物活性,通过多种信号途径参与调节机体免疫,维持皮肤正常的微生态环境,增强角质形成细胞功能,是皮肤屏障的免疫调节因素,其表达水平与某些感染性和炎症性皮肤病的严重程度相关,在皮肤病的治疗上也有广阔的前景.
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表皮抗菌肽的研究进展
抗菌肽是在多种生物体中表达的具有抗菌活性的肽类物质总称.皮肤频繁与环境中的微生物接触而不被感染,表皮抗菌肽起了重要作用.人类表皮抗菌肽主要包括防御素和cathelicidin家族的LL-37,由于其具有普通抗生素所不具有的一系列优点,使其生物学活性和与皮肤屏障的关系成为目前研究的热点,对其深入研究为抵御疾病、延缓衰老、相关皮肤病的发病机制及治疗等方面带来了新的希望.
关键词： 表皮 防御素类 Cathelicidins 皮肤屏障 -
抗菌肽对皮肤感染的保护作用
皮肤频繁与环境中的微生物接触而不被感染,阳离子抗菌肽起了重要作用.人类阳离子抗菌肽主要包括防御素和cathelicidin类的18 000人类阳离子抗菌蛋白衍生的LL-37.为此,综述角质形成细胞产生的人类防御素1、2、3和LL-37的抗炎抗菌特性和对皮肤的保护作用.
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防御素和皮肤病
防御素是近年来发现的一类小分子内源性抗菌肽,分子内富含精氨酸、半胱氨酸和二硫键,空间结构特殊,具有广谱抗菌活性,是天然免疫的重要介质,并与获得性免疫有较密切关系.文中对防御素的分子结构、分类、生物学活性及其在皮肤病领域的研究进展作了简述.
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致倦库蚊防御素基因的克隆与生物信息学分析
目的:获取致倦库蚊(贵阳株)防御素基因CxDefensin全长编码序列.方法:采用RT-PCR方法扩增致倦库蚊(贵阳株)CxDefensin开放阅读框(ORF)序列,并通过生物信息学方法分析其核苷酸和蛋白质序列.结果:CxDefensin ORF序列全长300 bp,编码99个氨基酸,包含1个内含子,蛋白质分子量是10.58 kDa,等电点为6.52.CxDefensi蛋白与其他昆虫的defensin蛋白具有同源性.结论:所获致倦库蚊(贵阳株)防御素基因CxDefensin归属昆虫防御素基因家族,为昆虫β型防御素.
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家蝇幼虫防御素基因的克隆和序列分析
目的: 克隆家蝇幼虫防御素(defensin)基因并进行序列分析.方法:根据Genbank公布的家蝇成虫defensin基因序列设计一对引物,以家蝇幼虫基因组DNA为模板,进行PCR扩增、测序,并利用软件进行序列分析.结果: 克隆得到的defensin基因的长度为330 bp,编码92个氨基酸,4个阳性克隆的DNA序列编码的多肽在第27位氨基酸残基不同,为K或N.结论: 从家蝇幼虫基因组DNA中克隆得到了defensin基因,发现了两种相差一个氨基酸残基的defensin前体蛋白,并初步预测了两种前体蛋白的化学性质和二级结构,为该基因的重组表达奠定了基础.
