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HIV-1 Tat蛋白对人类疱疹病毒8型复制的影响
用HindⅢ将HIV-1 Tat101蛋白编码基因从pEV质粒中切出,BamHI、NotⅠ将绿色荧光蛋白(GFP)编码基因从表达质粒pcDNA3.1 + /GFP中切出,分别插入到质粒LZRSpBM N-Z中,构建成重组反转录病毒表达质粒LZRS-Tat101和LZRS- GFP.采用磷酸钙转染法将两重组质粒转染到含反转录病毒env、gal 和pol编码基因的包装细胞Phoenix(ΦNX)中,嘌呤霉素筛选获得稳定细胞系.分别收集稳定细胞系分泌的病毒上清,并感染体外培养的原发性渗出性淋巴瘤(PEL)BCBL-1细胞.收集LZRS-GFP重组病毒感染的BCBL-1细胞进行流式细胞计数,检测GFP表达水平.收集L ZRS-Tat101重组病毒感染的BCBL-1细胞,提取蛋白作Wes tern blot,检测Tat蛋白表达状况;取细胞总RNA作Nort hern blot和定量PCR,检查HHV-8次要衣壳蛋白ORF26 mRNA转录水平.重组LZRS-Tat101病毒进一步感染HL3T1 细胞(HeLa细胞包含HIV-1-LTR/CAT报告基因),收集感染细胞提取蛋白,检测CAT活性,评价Tat生物学功能.PCR扩增H HV-8复制和转录激活蛋白Rta启动子区上游序列,并克隆至pGL-3 载体中,构建Rta启动子+虫荧光素酶(Luciferase)报告基因重组质粒.此重组质粒进一步电转染预先感染了LZRS-Tat101病毒的BC-3细胞,TPA刺激后收集细胞,检测Luciferase活性 .结果显示:①重组反转录病毒感染BCBL-1细胞,一次感染效率达56 %;②重组LZRS-Tat101病毒能够在其感染的BCBL-1细胞中表达Tat蛋白,且表达蛋白具有转录激活功能;③Tat蛋白不能有效上调 HHV-8 Rta启动子活性;④细胞内HIV-1 Tat蛋白诱导HH V-8可溶性周期复制的能力较弱.提示,单纯HIV-1 Tat蛋白并不能激活潜伏感染的HHV-8.
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含HIV-1 Tat基因重组反转录病毒表达载体构建与表达Tat蛋白功能检测
目的构建含HIV-1 Tat基因重组反转录病毒表达载体及评价表达Tat蛋白的功能. 方法使用HindⅢ将HIV-1 Tat101蛋白编码基因从pEV质粒中切出,插入到表达质粒LZRSpBMN-Z中,构建成重组反转录病毒表达质粒LZRS-Tat101.采用磷酸钙转染法将重组质粒LZRS-Tat101转染进含反转录病毒env、gal和pol编码基因的包装细胞phoenix(ФNX)中,嘌呤霉素筛选获得稳定细胞系.免疫组化(IHC)染色检查Tat在临时转染和稳定转染ФNX细胞中的表达水平.收集临时转染和稳定转染包装细胞分泌的病毒上清,并分别感染293细胞,Western blot检测Tat在293中表达.与此同时,收集感染293细胞培养上清,加入到HL3T1细胞(HeLa-HIV-1-LTR/CAT报告基因)中,共培养72*!h后收集细胞,提取蛋白作CAT活性检测. 结果①含Tat101基因重组反转录病毒表达质粒转染包装细胞后,Tat在临时转染ФNX中表达水平显著高于在稳定转染中的水平;②临时转染病毒感染293细胞,Tat在感染细胞中得到了表达,且分泌至上清中的Tat蛋白能够激活靶细胞HL3T1中HIV-1的LTR启动子,使得其下游的CAT基因得到表达. 结论重组LZRS-Tat101反转录病毒能够在其感染靶细胞中表达Tat蛋白,且表达蛋白具有转录激活功能.
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HIV-1Tat对细胞周期蛋白的影响
目的 研究HIV-1 Tat对细胞周期蛋白(cyclinB1)的影响.方法 利用人横纹肌肉瘤细胞(TE671)及已转染tat基因的TE671细胞(TT2)细胞系;通过Western印迹检测辐射前后CyclinBl表达变化;使用Northern-Blot及半定量RT-PCR,分析cyclinBl在mRNA水平表达;放线菌酮阻断蛋白合成实验及免疫共沉淀实验检测cyclinB1的稳定性.结果 细胞在接受电离辐射和未接受照射情况下,cyclin B1的表达在转染tat基因细胞中明显增强,Tat蛋白不影响cyclinBl在mRNA水平的表达;放线菌酮阻断蛋白合成实验及Tat蛋白诱导细胞电离辐射后泛素化实验均表明,cyclinB1表达水平的增强主要发生在蛋白质合成后的修饰.结论 HIV-1 Tat蛋白能提高Cyclin Bl的稳定性,降低CyclinB1泛素化水平;该项研究也许有助于利用分子生物学手段,干预Tat蛋白的表达以调控CyclinB1及相关蛋白的表达,进而改变肿瘤细胞周期的进程,影响临床的疗效.
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HIV-1 Tat 蛋白对细胞周期相关基因表达及辐射细胞周期阻滞的影响
目的:探讨HIV-1 Tat蛋白对细胞周期相关基因表达以及电离辐射诱发细胞周期阻滞的影响.方法:使用包含102个与DNA损伤修复和细胞周期相关的基因微阵列检测人横纹肌肉瘤细胞(TE671)及已转染tat基因的TE671细胞(TT2)基因表达谱的改变;使用流式细胞仪检测细胞周期变化;Western印迹检测蛋白表达变化.结果:在基因芯片的检测中发现,与DNA损伤修复及细胞周期调控相关的6个基因Cdc25C,KIF2C,Cdc20,DNA-PKcs,CTS1,Wee1在转染tat基因的细胞中表达下调;细胞周期检测发现TE671细胞和TT2细胞经4 Gy γ射线照射后表现出不同程度的G2/M期阻滞,但表达Tat的TT2细胞G2/M阻滞出现较TE671细胞晚,而在照射后48 h时TE671细胞G2/M期阻滞已恢复,但TT2细胞阻滞仍很显著.另外,TT2细胞S期阻滞时间延长.研究进一步发现细胞周期蛋白(cyclin)B1在TT2细胞中表达增强.结论:HIV-1Tat蛋白导致G2/M检验点功能紊乱,将影响细胞的辐射敏感性,本研究为了解AIDS合并肿瘤患者对放射治疗敏感性提供了重要实验数据.
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Rho/ROCK信号通路在HIV-1 Tat诱导血脑屏障破坏及β淀粉样蛋白沉积中的作用
目的 探讨Rho/ROCK信号传导通路在人类免疫缺陷病毒-1型反式转录激活因子(HIV-1 transactivator of transcription,HIV-1 Tat)诱导血脑屏障破坏及对β淀粉样蛋白(Amyloid-beta,Aβ)沉积中的作用.方法 将培养的人脑微血管内皮细胞(human cerebral microvascular endothelial cells,hCMEC/D3)予以不同浓度的Rho/ROCK信号传导通路抑制剂盐酸法舒地尔(Hydroxyfasudil,HF)刺激细胞,并设立对照组,观察其对细胞活力的影响,分别予以HIV-1 Tat、HF刺激细胞,以蛋白免疫印迹法和实时反转录聚合酶链式反应(real-time reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)检测hCMEC/D3中紧密连接蛋白Occludin、晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end products,RAGE,转移血液Aβ到脑组织)的蛋白和mRNA表达的变化.结果 HF在30μmol/L(0.17±0.02)以下时对hCMEC/D3活力无明显影响(P＞0.05).HIV-1 Tat能抑制hCMEC/D3的Occludin 蛋白(0.71±0.03、P＜0.001)与mRNA(0.41±0.05、P＜0.05)表达,同时上调RAGE蛋白(0.83 ±0.01、P＜0.001)和mRNA(1.93±0.66、P＜0.05)表达.HF预处理细胞2h后与HIV-1 Tat共培养可以显著增加Occludin蛋白与mRNA的表达(0.93±0.03、P＜0.001;1.04±0.45、P＜0.05),同时可以明显减少RAGE蛋白与mRNA的表达(0.54±0.01、P＜0.001,1.08±0.43、P＜0.05).结论 HIV-1 Tat可使紧密连接蛋白Occludin蛋白和mRNA表达下调导致血脑屏障破坏,诱导Aβ转运受体RAGE的蛋白和mRNA过度表达,从而可能导致Aβ在脑内沉积增加;阻断Rho/ROCK信号传导通路可抑制HIV-1 Tat诱导血脑屏障破坏作用,阻止RAGE蛋白和mRNA的过度表达.
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雌二醇对HIV-1 Tat诱导紧密连接蛋白破坏的影响
目的 探讨人类免疫缺陷病毒-1型反式转录激活因子(HIV-1 transactivator of transcription,HIV-1 Tat)对血脑屏障(Blood-Brain Barrier,BBB)中紧密连接(tight junctions,TJs) Claudin-1、ZO-1和ZO-2蛋白表达的影响及17-β雌二醇(17-βestradiol,E2)对HIV-1 Tat诱导的紧密连接蛋白破坏的影响作用.方法 同代人脑微血管内皮细胞(human brain endothelial cells,hCMEC/D3)分为培养基对照组(CTL组)给予无血清培养基处理;Tat+ E2组以浓度10-8 mol/L E2预处理2h后,再加入1μg/ml HIV-1 Tat共处理24 h;E2组给予10-8mol/L E2处理24 h;Tat组给予1 μg/ml HIV-1 Tat处理24 h.采用蛋白免疫印迹(Western blot,WB)技术检测hCMEC/D3中Claudin-1,ZO-1和ZO-2蛋白表达.结果 HIV-1 Tat可诱导Claudin-1、ZO-1和ZO-2蛋白表达下调(分别P＜0.05,P＜0.01,P＜0.01);E2可介导Claudin-1,ZO-1的蛋白表达上调(P＜0.01,P＜0.05),然而对ZO-2蛋白表达无显著性差异(P＞0.05);E2可抑制HIV-1 Tat诱导Claudin-1,ZO-2的蛋白表达下调(P ＜0.05,P＜0.01),但对ZO-1蛋白表达水平无显著性的差异(P＞0.05).结论 HIV-1 Tat可诱导脑微血管内皮细胞间紧密连接Claudin-1,ZO-1和ZO-2的蛋白降解,破坏BBB完整性和通透性,而E2通过抑制HIV-1 Tat诱导紧密连接蛋白Claudin-1,ZO-2降解,对BBB起重要保护作用.
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HIV-1 Tat蛋白的生物学特性及其致病效应
Tat蛋白是HIV-1编码的重要调控蛋白,在病毒复制和感染致病中起重要作用.在感染细胞内,Tat蛋白与多种细胞分子相互作用,启动病毒基因组的转录,促进转录延伸,从而激活和促进病毒复制;分泌和释放至细胞外的Tat蛋白,具有独特的穿膜功能,可到达宿主多个部位,作用于多种细胞,产生多样的Tat蛋白胞外活性,如参与免疫抑制、神经系统损伤及卡波济肉瘤形成等致病过程,被称为"病毒毒素".本文对Tat蛋白的生物学特性及其致病效应作一综述.
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Tat蛋白转导结构域介导HSV1-TK导入肝癌细胞及其效应
目的:探讨HIV-1编码的反式激活蛋白Tat与HSV1-TK融合表达对肝癌细胞的杀伤效果.方法:合成编码HIV-Tat47-57(Tat11)的2条寡核苷酸单链,两端分别引入BamH Ⅰ和HindⅢ两个酶切位点,退火形成寡核苷酸双链,15%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳判断退火效果;以r-pAs16Dr为模板,通过PCR扩增HSV1-TK基因,定向克隆至原核表达载体pET32中.将含pET-32c-Tat11-TK的BL21菌通过IPTG诱导表达,表达产物用Ni2+螯合柱亲和纯化,免疫组化分析重组蛋白Tat11-TK的膜结合特性,蛋白印迹技术分析该融合蛋白的穿膜能力,检测和分析TK/GCV、Tat11-TK/GCV对肝癌细胞株HepG2的杀伤作用.结果:表达产物SDS-PAGE在相对分子质量60 700左右显示条带,符合Tat11-TK与表达标签融合蛋白的理论值,并证明以包涵体的形式表达;通过Ni2+螯合柱亲和纯化获得的Tat11-TK重组融合蛋白,经免疫组化证实能结合到肝癌细胞表面,蛋白印迹结果说明Tat11-TK能有效穿过细胞膜进入HepG2细胞内,同时应用低浓度前药更昔洛韦(GCV,150μmol/L)能有效抑制HepG2细胞生长.结论:Tat 11-TK在原核系统获得高效表达,具有较强的穿膜能力和前药酶活性.
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HIV-1 Tat蛋白结合Tar的抗艾滋病药物筛选模型的建立研究
目的 建立HIV-1 Tat蛋白结合Tar的抗HIV-1药物筛选模型用于抗HIV药物筛选.方法 构建表达HIV-1Tat蛋白的真核表达质粒(pCDNA3.1(+)-Tat)和HIV-1 LTR-luc荧光素酶报告基因,采用脂质体转染法共转染HeLa细胞,荧光仪检测Tat蛋白促进荧光素酶在HeLa细胞内的表达情况,建立HIV-1Tat蛋白结合Tar的细胞模型,用于抗HIV-1的药物筛选.以DRB(5,6-二氯-1-β-呋核亚硝脲-苯并咪唑)为阳性对照,进行模型的建立及条件的优化.结果 通过反复试验表明,目的 基因和报告基因的配比、转染时培养液中小牛血清的含量、细胞浓度、转染前细胞状态以及药物作用时间的长短等对模型的稳定性和敏感性有影响.结论 应用优化的细胞模型对文冠果、紫苏等浸提物进行筛选及结果的分析.
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HIV-1 Tat基因在pEGx-KG中的融合构建及原核表达
目的:在大肠杆菌BL21 (DE3)中高效表达融合的Tat蛋白.方法:用PCR方法从HIV cDNA文库中扩增出Tat基因,并将其插入到表达载体pEGx-KG中, 转化到E.coli 中进行融合表达, 表达产物用蛋白电泳和Western-blot进行鉴定.结果:成功地构建了重组质粒pEGx-KG-Tat, 重组质粒在大肠杆菌BL21 (DE3)中得到高效表达.蛋白电泳和Western-blot分析表明, 在相对分子质量(M r )为38.9 kDa处有1条特异性的带.结论:GST基因与H IV-1 Tat基因的融合构建, 使Tat蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,为艾滋病的防治研究奠定了基础.
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HIV-1 Tat蛋白促血管生成作用研究进展
Tat蛋白是HIV-1基因组编码的6个调控蛋白中一个重要的调控蛋白,在艾滋病相关卡波西肉瘤的发生发展中起一定作用.本文综述了细胞外HIV-1 Tat蛋白促血管生成作用的新研究进展,包括Tat不同结构区域在促血管生成中所起的作用,以及与各种生长因子及化学因子之间的相互作用,阐述了Tat促内皮细胞及卡波西肉瘤细胞血管生成的主要机制,为临床开发拮抗Tat的促血管生成作用药物,抑制AIDS相关卡波西肉瘤的发生及发展提供理论依据.
