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鹅细小病毒主要免疫原性蛋白基因的克隆与序列分析
利用PCR技术,从纯化鹅细小病毒SYG99-5毒株鹅胚尿囊液中扩增出病毒主要免疫原性蛋白基因.将该PCR扩增片段克隆入pGEMR-T质粒载体的HincⅡ和SacⅠ位点之间,酶切分析筛选并进一步通过Southern杂交验证后,获得含1.6kb基因片段的重组质粒GpG3.序列测定结果表明,该片段与国外已报道的GPV B株苷酸序列有96%的同源性,氨基酸序列有97%的同源性.
关键词： 鹅细小病毒 聚合酶链式反应 VP3基因 Southern杂交 重组质粒 -
HCV 5′NCR转基因细胞HepG2.9706的特性分析
丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)引起的威胁人类健康的重要传染病,迄今尚无有效的疫苗及特异性抗病毒治疗药物.抗HCV药物的研究和开发面临的关键问题是缺乏合适的HCV感染细胞及动物评价模型.转基因细胞模型是研究人类疾病常用的有效手段,因此,在HCV分子生物学进展的基础上,我们以对HCV翻译与复制有明显调控功能的HCV 5′NCR及部分翻译起始区序列为靶标,构建了HCV 5′NCR及部分多聚蛋白起始区序列与荧光素酶基因的融合基因,插入真核表达载体,转染HepG2细胞,获得了HCV 5′NCR转基因细胞HepG2.9706细胞株[1].本文对该细胞的某些特性进行了分析,以便更好地利用该细胞模型进行药物评价.
关键词： HepG2.9706细胞株 荧光定量PCR Southern杂交 拷贝数 荧光素 -
致肾盂肾炎大肠杆菌特异性片段R049聚集性分布的研究
目的 研究致肾盂肾炎大肠杆菌(UPEC)132特异性片段R049在UPEC菌株和正常人粪便分离的大肠杆菌菌株中的分布情况.方法 对20株UPEC和加株粪便分离大肠杆菌采用PCR方法扩增R049片段,对R049阳性菌株检测编码5种毒力因子的基因(papC、fimH、hly、aer、cnf1),并对其基因组DNA用Xba Ⅰ酶切,进行脉冲场凝胶电泳分析,继而用毛细管法将DNA片段转移至尼龙膜,利用地高辛标记的R049 ORF探针片段进行Southem杂交,分析杂交条带的分布特征.结果 20株UPEC中有8株(40%)、40株粪便分离的大肠杆菌中有3株(7.5%)R049片段扩增阳性,两组差异有统计学意义(P<0.01).R049阳性菌株中,R049片段与5种UPEC毒力因子密切相关.Southem杂交结果表明3株粪便分离大肠杆菌R049阳性杂交带分别为150 kb、15 kb与240 kb;8株UPEC中有6株阳性杂交带均为350 kb,其余2株分别为280 kb和25 kb.结论 UPEC132特异性片段R049在国内分离的UPEC菌株中具有共有性和聚集性分布的特征.
关键词： 致肾盂肾炎大肠杆菌 R049片段 脉冲场凝胶电泳 Southern杂交 -
肝癌患者手术后外周血AFP mRNA的检测及其与术后复发的关系
目的 探讨肝癌患者手术后外周血AFPmRNA的检测及其与术后复发的关系.方法 原发性肝癌手术治疗患者29例,对照组为15例非原发性肝癌但须行肝部分切除手术者.分离术后第1,7和14天外周血单个核细胞,提取单个核细胞的总RNA,进行RT-PCR和Southern杂交,检测AFP mRNA,并对肝癌患者进行36个月的随访.结果 全组有18例原发性肝癌患者复发.术后3次检测外周血AFP mRNA不全阴性者17例,其中14例复发,复发率为82.4%;3次检测均为阴性者12例,有4例复发,复发率为33.3%,差异有统计学意义(P＜0.05).对照组手术后外周血AFP mRNA检测均为阴性.结论 原发性肝癌患者手术后外周血AFP mRNA的检测可以预测肝癌的复发情况.
关键词： 肝肿瘤 AFP mRNA 肿瘤复发 RT-PCR Southern杂交 -
脆性X综合征临床特征及分子生物学研究
目的:为了探讨脆性X综合征特征及简便、快速的检测方法.方法:对不明原因智力低下和癫痫伴智力低下患者共1023例家系进行了细胞遗传学和分子生物学检查.结果:检出脆性X染色体阳性98例,检出率为9.6%,其中产前诊断4例阳性.临床特征观察,除一般临床表现外发音缺陷,行为异常,家系调查在该征患者27例中有9例癫痫发作,发生率为33.33%.结论:临床特征结合分子生物学检查可用于脆性X综合征的筛查、诊断及产前诊断,是防止患儿出生的重要手段.
关键词： 脆性X综合征 携带者 智力低下 癫痫 Southern杂交 -
不同种属间成纤维细胞生长因子受体1限制片段多态性的初步研究
目的:研究成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)基因在不同种属间的限制片段多态性.方法:提取小鼠、鸡、家兔的基因组DNA,以FGFR1 cDNA片断为探针进行Southern杂交分析.结果:各种属的组织分别得到不同形态的带条,即不同种属间的FGFR1限制片段多态性不同.结论:在物种进化过程中FGFR1在基因组水平上发生了变化,其限制性片段多态性的分析可能作为研究物种起源与种间亲源关系的辅助手段.
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外周血中白蛋白mRNA作为肝癌微小转移标志物的进一步研究
目的检测不同肝脏疾病患者的外周血中白蛋mRNA(ALB mRNA),探讨外周血中ALB mRNA作为肝癌微小转移标志物的特异性.方法分离原发性肝癌患者以及肝硬化、急慢性肝炎、肝转移癌、肝脏良性肿瘤患者和健康志愿者的外周血单个核细胞,提取单个核细胞的总RNA,进行RT-PCR,将RT-PCR产物再进行Southem杂交.结果原发性肝癌患者组外周血中ALB mRNA的检出率为44.8%,对照组检出率为29.2%,两者之间的差异无统计学意义(P≥0.05).结论作为肝癌微小转移的检测标志物ALB mRNA的特异性不高.
关键词： 肝细胞癌 微小转移 白蛋白mRNA 逆转录聚合酶链反应 Southern杂交 -
外周血甲胎蛋白mRNA和白蛋白mRNA在评估肝癌微小转移中的比较研究
目的探讨肝病患者外周血甲胎蛋白mRNA(AFP mRNA)和白蛋白mRNA(ALB mRNA),作为肝癌微小转移标志物的特异性.方法提取患者和健康志愿者的外周血单个核细胞总RNA,进行RT-PCR,扩增产物再进行Southern杂交.结果原发性肝癌(HCC)组外周血AFP mRNA的检出率为41.4%,对照组为0%,差异显著(P＜0.05);HCC组外周血ALB mRNA的检出率为44.8%,对照组为29.2%,二者差异无统计学意义(P＞0. 05).结论作为肝癌微小转移的标志物,外周血AFP mRNA的特异性高于ALB mRNA.
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RT-PCR/Southern杂交法检测穹窿海马伞切割大鼠海马Brn-4 mRNA的表达变化
目的:探讨切割穹窿海马伞大鼠海马与正常海马内Brn-4 mRNA表达的差异.方法:42只SD大鼠随机分成正常对照组和切割穹窿海马伞后1、3、7、14、21及28 d组.取各组大鼠的海马组织,提取总RNA,采用RT-PCR/Southern杂交方法分析穹窿海马伞切割后海马内Brn-4 mRNA的表达变化.结果:海马内Brn-4 mRNA的表达量在切割后第3 d开始升高,14 d达到高水平,随后下降,28 d左右恢复至正常水平.结论:切割穹窿海马伞后海马内Brn-4 mRNA表达明显上调,可能与促进海马内移植的或自体的神经干细胞向神经元分化有关.
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苦瓜基因组DNA提取方法的比较研究
目的 研究不同方法提取的苦瓜基因组DNA的质量.方法 用酚-氯仿法、改良CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法、试剂盒法提取苦瓜基因组DNA,用Southern杂交和内参PCR检测提取DNA的质量.结果 改良CTAB法提取的苦瓜基因组DNA A260/A280=1.85,A260/A230=1.96,Southern杂交检测和PCR扩增都显示内参条带.结论 改良CTAB法是提取苦瓜基因组DNA的适方法.
关键词： 苦瓜 CTAB改良法 基因组DNA Southern杂交 -
霍乱弧菌含编码霍乱毒素基因的溶源性噬菌体转染检测
[目的]研究霍乱毒素基因(ctx)在霍乱弧菌O1群埃尔托型、古典型菌株和O139群菌株之间的传递现象,了解含编码霍乱毒素基因的溶源性噬菌体(CTXΦ)在ctx基因转移中的作用.[方法] 从人工构建的供体菌中诱导出带有标记的CTXΦ并转染至受体菌,用PCR扩增和Southern杂交等方法检测受体菌、转染子及其质粒的目的基因片段.[结果]从受体菌O395、569B(古典型)和80071(埃尔托型)的转染子中均检出带有供体菌标记的质粒, PCR和Southern杂交结果表明这些质粒是CTXΦ的复制形式.[结论]ctx基因能通过CTXΦ在不同霍乱弧菌间进行传递.
关键词： 霍乱弧菌 CTXΦ 转染 PCR Southern杂交 -
山东省首次检出O157大肠埃希菌志贺毒素Ⅱ变种
目的:了解山东省E.coli O157大肠埃希菌携带Stx2及Stx2vha情况.方法:采用从山东省5个监测点腹泻病人和家禽、家畜等粪便标本中分离的O157大肠埃希菌,用PCR方法检测特异性志贺毒素2及其变种毒素;提取菌株的染色体DNA进行限制性内切酶PstI消化,使用slt2探针进行Southern杂交检测菌株毒素的变化情况.结果:从腹泻病人、家禽家畜等粪便标本分离的O157大肠埃希菌PCR检测STL2(c,d)阳性的 9株,用slt2探针杂交方法检测有4株为Stx2vha阳性,其中1株杂交带型不同于其他菌株,是否为新的毒素变种需进一步研究.结论:山东省从腹泻病人和外环境分离的O157大肠埃希菌存在志贺毒素Ⅱ变种.
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RT-PCR/Southern杂交方法检测肝癌患者外周血AFP mRNA
目的寻找一种敏感的方法以检外外周血中的肝癌细胞.方法分离原发性肝癌患者以及肝硬化、急慢性肝炎、肝转移癌、肝脏良性肿瘤患者和健康志愿者的外周血单个核细胞,提取单个核细胞的总RAN,进行RT-PCR/Southern杂交检测AFPmRNA.结果原发性肝癌患者外周血AFP mRAN的检出率为41.4%,其检出率与肿瘤大小以及TNM分期有关,对照组均为阴性.结论肝癌患者外周血中的AFPmRNA可以作为肝癌细胞的血液微小转移的标志物.
关键词： 肝细胞癌 微小转移 AFP mRNA 逆转录聚合酶链式反应 Southern杂交 -
半夏、水半夏RAPD分析及构建特异DNA探针
目的:建立鉴定半夏、水半夏的分子标记方法.方法:利用22条随机引物,对四川两种半夏、广西两种水半夏基因DNA进行RAPD扩增,并对其差异条带进行测序、标记构建探针和Southern杂交.结果:半夏、水半夏基因DNA之间扩增的差异条带较多.通过测序、标记构建探针和杂交确认一半夏特异的标记分子.结论:通过RAPD和构建特异DNA探针能准确鉴别半夏和水半夏.
关键词： 半夏 水半夏 RAPD技术 特异DNA探针 Southern杂交 -
多重实时PCR对宫颈癌组织及SiHa细胞株HPV-16病毒存在状态的检测
背景与目的:人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染与宫颈癌发生发展密切相关,高危型HPV病毒整合入宿主细胞是细胞转化及癌变的关键.病毒整合状态的检测对深入探讨宫颈癌发生发展机制及预测宫颈病变的转归有一定的临床意义.然而目前尚没有一种理想的能够用于各种临床标本的HPV存在状态的检测方法.本研究旨在探讨HPV-16存在状态的理想检测方法.方法:以HPV-16质粒为标准品,利用两种不同的荧光报告基团,采用多重实时PCR同管定量检测HPV-16 E2和E6基因,根据E2和E6基因拷贝数的比值(E2/E6)来判定HPV-16的存在状态;对HPV-16阳性的宫颈癌SiHa细胞和27例宫颈鳞癌新鲜标本进行多重实时PCR与Southern杂交检测,将两种检测方法的结果进行比较.结果:(1)多重实时PCR所得到的HPV-16 E2、E6标准曲线相关性好,相关系数均为1.00,扩增效率均在95%以上.(2)对系列稀释的HPV-16质粒进行重复检测,确定了E2/E6比值为1时该多重实时PCR检测系统的95%参考值范围为0.81～1.29,以0.81作为区分游离型和混合型HPV-16的界值.(3)多重实时PCR与Southern杂交检测均发现SiHa细胞中HPV-16呈整合型,27例鳞癌中22例获得了一致的检测结果,符合率为81.5%,Kappa值为0.844,P＜0.001.结论:多重实时定量PCR是一种可靠的、便于临床应用的检测HPV-16病毒存在状态的方法,具有省时、简便快速、高通量的优点,并且能用于石蜡切片以及病灶较小、DNA含量少的宫颈癌前病变组织或宫颈细胞学标本.
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Huntington舞蹈病Southern杂交诊断方法的建立
目的 建立诊断Huntington舞蹈病的Southern杂交方法.方法 PCR法扩增-497 bp的片段,克隆测序验证后再从质粒上切下来,用非放射性同位素地高辛标记作为探针,以经克隆测序知道IT15基因CAG重复次数为43次的个体作为阳性对照,正常个体作为阴性对照对20侧临床诊断为Huntington舞蹈病的疑似个体行Southern杂交检测.结果 11例病人排除Huntington舞蹈病,9名病人被确定为Huntington舞蹈病患者.结论 建立了用非放射性同位素地高辛标记的探针鉴定Huntington舞蹈病的Southern杂交方法,该方法准确可靠.
关键词： Huntington舞蹈病 Southern杂交 -
成纤维细胞生长因子受体1(FGFR-1)基因在人肠癌组织中的变化
为观察人FGFR-1基因变化与结肠癌发生的关系.采用RT-PCR法从人肺成纤维细胞中钓取FGFR-1全编码区cDNA,用此cDNA探针与人肠癌及癌旁组织DNA进行Southern印迹分析.结果表明:与癌旁组织相比结肠癌组织Southern印迹图谱发生了改变.提示PGFR-1基因变化与肠癌发生可能存在一定相关性.
关键词： FGFR-1基因 结肠癌 Southern杂交 -
CDKN 2/p16基因甲基化失活与肺癌关系的研究
目的:研究CDKN2/p16基因5′端调控序列区CpG岛甲基化的状态与肺癌发生发展的关系.方法:采用甲基化敏感性核酸内切酶酶切基因组DNA的方法,对89例肺癌的CDKN2/p16基因进行了Southern杂交分析.结果:89例肺癌发现该基因甲基化21例,甲基化频率为23.6%(21/89),其中17例发生于42例P16蛋白阴性表达的患者.结论:CDKN2p/16基因5′端CpG岛甲基化可能是该基因失活的重要机理,参与肺癌的发生发展过程.
关键词： 肺肿瘤 CDKN2/p16基因 甲基化失活 核酸内切酶 Southern杂交 -
臆断引物-聚合酶链反应分析配对胃腺癌组织与非癌胃组织基因组的差异基因
目的研究同一胃腺癌患者的配对胃腺癌组织与非癌胃组织基因差异,并对差异基因片段进行克隆,Southern印迹杂交.方法应用随意扩增多态性DNA指纹图谱分析技术(arbitrarily primer polymerase chain reaction,AP-PCR),即臆断引物的无细胞分子克隆技术,亦称臆断引物的聚合酶链反应,对5例配对标本作基因组差异分析.结果与各自配对的非癌胃组织相比,所有胃腺癌组织基因组DNA的AP-PCR指纹图谱均存在变异,并克隆了其中1例仅存在于肿瘤组织基因组的差异扩增片段PW2.2.Southern印迹杂交发现此PW2.2也存在于其他部分胃腺癌标本的随机扩增产物中.结论 AP-PCR技术可为差异基因分析和克隆提供一快速而有效的方法.
关键词： 臆断引物聚合酶链反应 胃腺癌 变异基因 克隆 Southern杂交 -
第一类整合子整合酶基因intI1的定位分析
目的整合子(integrons)介导的细菌耐药特性已成为研究细菌耐药机制的热点,在研究了来自正常人携带沙门氏菌中整合子的分布和特性的基础上,进一步探讨整合子的基因定位.方法从已鉴定的整合子阳性菌株出发,分别提取其质粒和染色体DNA,进行质粒的接合转移试验.对染色体DNA进行限制性酶切,以第一类整合酶基因intI1(DIG标记)为探针,进行Southern杂交.结果4株整合酶阳性菌株不存在含有第一类整合子的接合性质粒,确定4株整合子阳性菌株的整合酶基因intI1基因位于染色体上.结论本文发现的整合子阳性菌株对耐药基因的捕获是通过染色体DNA介导的.
关键词： 整合子 整合酶 质粒结合 Southern杂交
