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深圳登革热患者血清中2型病毒株的分离鉴定
目的:对深圳市2004年-2006年登革热病原体进行分离鉴定.方法:采用酶链免疫吸附试验和胶体金免疫层析法检测疑似登革热患者血清中的特异性IgM、IgG抗体.用C6/36细胞对早期病例血清进行病毒分离,以MGB荧光PCR方法鉴定.并用逆转录-半套式PCR(RT-semi-nested-PCR)方法和荧光PCR方法对其进行型别鉴定.结果:从10份抗体阳性的病人血清标本中成功分离到一株登革病毒,经鉴定为登革2型病毒,将其命名为DEN2-SZ0521.结论:首次从深圳市登革患者血清中分离到一株登革2型病毒,为进一步研究和控制该地区登革热提供了科学依据.
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登革2型病毒B株E基因部分序列原核蛋白表达及单克隆抗体制备
目的 通过构建登革2型病毒B株E基因区1～476 bp的原核表达载体,进行原核表达,并制备单克隆抗体,为研制登革病毒诊断试剂奠定基础.方法 将登革2型病毒B株E基因序列克隆入原核表达载体pET28a(+),构建原核表达重组体pET28a(+)-E,将重组表达载体转化BL21(DE3)菌株进行原核表达.纯化后的蛋白免疫BALB/e小鼠,经融合、筛选制备特异性单克隆抗体.结果 成功构建了pET28a(+)-E原核表达重组质粒,SDS-PAGE分析表明,E基因区部分序列获得高效表达,获得了1株持续分泌抗E蛋白抗体的杂交瘤细胞株8B3,该单抗为IgG2a亚类.结论 成功制备了抗E蛋白mAb,为对登革病毒引起感染的早期诊断提供了有力的工具.
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C6/36细胞上登革2型病毒受体的免疫共沉淀
本文利用差速离心方法提纯的登革2型病毒、抗登革病毒单抗、病毒受体、耦合有G蛋白的琼脂糖珠之间特异性结合的作用,利用免疫共沉淀方法从C6/36细胞中分离鉴定出分子量约为35kDa受体蛋白;并用糖蛋白染色方法否定了此蛋白的糖基化特征.
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登革2型病毒E蛋白结构域Ⅲ的表达及多克隆抗体制备
登革病毒(Dengue virus, DENV)属于黄病毒科(Flaviviridae),黄病毒属(Flavivirus),为单股正链RNA病毒,有4个不同的血清型(DENV- 1,2,3,4),主要通过埃及伊蚊(Aedes aegypti)和白纹伊蚊(Aedes albopictus)传播,可引起登革热、登革出血热、登革休克综合征等多种疾病 [1,2].
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登革2型病毒NS2BH-NS3蛋白酶复合物的原核表达及活性研究
目的 通过原核表达获得登革2型病毒NS2BH-NS3pro重组蛋白,并对其蛋白酶活性进行初步研究.方法 通过引入G4TG4连接臂,利用重叠PCR扩增登革2型病毒NS2BH和NS3pro基因序列,构建pET-28b-NS2BH-G4TG4-NS3pro蛋白酶复合物原核表达载体,采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术对纯化后重组蛋白进行鉴定,FRET技术检测其蛋白酶活性.结果 成功构建pET-28b-NS2BH-G4TG4-NS3pro原核表达载体,获得与预期分子量大小相符且纯度较高的可溶性蛋白,质谱分析表明重组蛋白为登革2型病毒NS2BH-NS3pro蛋白酶复合物,具有较高的蛋白酶活性.结论 基因工程技术获得的NS2BH-G4TG4-NS3pro重组蛋白为后续登革病毒蛋白酶适配体抑制剂的筛选奠定了基础.
关键词： 登革2型病毒 NS2BH-NS3pro 原核表达 蛋白酶活性 -
登革2型病毒特异性抗原片段的筛选及验证
目的 筛选、鉴定登革2型病毒特异性抗原,为进一步研究其生物学功能奠定基础,并利用纯化抗原建立检测登革2型病毒抗体的ELISA方法.方法 分别利用DNAStar及ANTHEPROT软件对登革病毒1-4型、流行性乙型脑炎及黄热病毒M、E蛋白进行分析,分析登革2型病毒型特异性抗原表位,并参考GenBank中的序列信息进行比对,分析其在不同登革2型病毒株中的保守性.然后选择预测得分值较高的表位,利用pET32a原核表达系统进行原核表达,Western blotting验证其免疫学反应特异性,特异性片段经亲和层析纯化后,包被ELISA微孔板,并对ELISA反应条件进行系统优化.结果 经系统的生物信息学分析,初步预测获得登革2型病毒特异性抗原表位8个,并对其中得分值较高的6段进行了高效表达,经Western blotting分析,获得登革2型病毒特异性抗原片段1段.经纯化后作为检测用抗原,建立了检测登革2型病毒抗体的ELISA方法.初步应用表明,所建立方法具备良好的特异性,可检测1～200倍稀释的患者血清,S/N比值均在10以上.结论 获得登革2型病毒特异性抗原片段1段,并建立检测登革2型病毒抗体的ELISA方法.
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登革2型病毒NGC株基因组亚克隆的构建及其鉴定
目的构建登革2型病毒NGC株基因组全序列的亚cDNA克隆,为进一步构建全长感染性cDNA克隆奠定基础.方法根据登革2型病毒NGC株基因组全序列中的酶切位点设计2对引物,从病毒感染的乳鼠脑中提取RNA,采用长链RT-PCR技术扩增出覆盖病毒基因组全长的2个cDNA片段,并克隆至pCR-XL-TOPO载体后测序.结果经酶切鉴定和序列测定表明,获得的cDNA克隆为登革2型病毒NGC株特异的.结论已成功构建出登革2型病毒NGC株基因组的2个cDNA亚克隆.
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西双版纳州2016年登革1型和2型病毒疫情的流行病学调查
目的 了解云南省西双版纳州2016年登革热流行特征和登革病毒血清型、基因型及其传播来源.方法 收集登革热病例资料,采集患者急性期血清标本,用RT-PCR法检测登革病毒核酸,并进行登革病毒C/PrM区核苷酸序列测定和进化分析.结果 2016年西双版纳州共确诊登革热病例53例,其中本地感染病例24例(勐腊县21例和景洪市3例),输入性病例29例(来自缅甸24例和老挝5例).流行月份为7-11月.病例年龄以20～49岁组为主,男女性别比为1.9∶1.蚊媒监测景洪5-10月布雷图指数(Breteau index,BI)为8.4～21,勐腊6-10月BI为7.6～18.2,勐海县9-10月BI为8.4～8.8,其它月份BI均小于5.从患者血清中获得13株登革病毒的C/PrM区基因核苷酸序列,进化分析表明,10株为登革病毒血清型1型(DENV-1)中的基因Ⅰ型(Genotype-Ⅰ,G-Ⅰ),3株为登革病毒血清型2型(DENV-2)的亚洲基因Ⅰ型(Asian genotypeⅠ,AG-Ⅰ),均为东南亚地区的优势基因型.无论DENV-1或DENV-2均与近几年云南省瑞丽市、临沧市和东南亚地区的同型流行株具有较近的亲缘关系.结论 西双版纳州2016年发生了包括本地和输入性病例并存的DENV-1 G-Ⅰ和DENV-2 AG-Ⅰ流行,并证实相邻的缅甸和老挝边境地区存在这两种血清型登革病毒流行,来自缅甸和老挝的输入性病例是引起西双版纳本地流行的主要原因.此为西双版纳首次发生DENV-1和DENV-2 AG-Ⅰ的本地流行.
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登革2型病毒NS1-NS2a基因真核表达载体的构建及鉴定
目的 构建登革2型病毒NS1-NS2a基因真核表达质粒.方法 RT-PCR扩增NSI-NS2a基因片段后,将其克隆人真核表达载体pReceiver-M01a;过PCR、酶切、测序和间接免疫荧光染色鉴定重组质粒.结果 经PCR扩增、酶切和测序验证,重组质粒构建正确,命名为pRe-NS1-NS2a;重组质粒转染Vero细胞后,间接免疫荧光染色显示细胞质中有登革2型病毒特异性蛋白的表达.结论 成功构建了真核表达质粒pRe·NS1-NS2a.
关键词： 登革2型病毒 NS1-NS2a基因 真核表达 -
登革2型病毒NS3基因的酵母表达及其免疫反应性的测定
目的克隆登革2型病毒(DEN2)NS3基因并用酵母真核表达,获得全长的重组NS3蛋白质,为其结构与功能的研究提供条件.方法从感染DEN2(NGC株)后病变的C6/36细胞上清液中提取RNA,通过RT-PCR扩增NS3基因片段,与载体pPICZαB连接筛选得到重组质粒,电穿孔法将重组体整合入酵母菌P.pastoris,经抗生素Zeocin筛选产生的转化子进行表型鉴定,取Mut+菌诱导表达,SDS-PAGE检测表达产物.结果 RT-PCR得到1.85kb的NS3基因片段,酶切鉴定与测序显示重组质粒含DEN2全长NS3基因;Mut+酵母转化菌可分泌表达Mr约78 000的蛋白质,与DEN2多抗和登革2型病毒患者恢复期血清的免疫印迹证实它为型特异的重组NS3蛋白质.结论成功将克隆的全长DEN2 NS3基因在酵母菌中表达,获得的重组NS3蛋白质具有免疫反应性.
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登革2型病毒对人血管内皮细胞自噬的影响
目的:研究登革2型病毒NGC株(DEN2)感染人血管内皮细胞(HUVEC)后对HUVEC自噬的影响.方法:采用免疫组织化学法检测Ⅷ因子表达,鉴定HUVEC,50％组织细胞感染量(TCID50)测定DEN2 NGC株对白纹伊蚊C6/36细胞的毒力,实时荧光定量PCR检测感染DEN2的HUVEC中病毒mRNA表达水平的变化,Western-blot检测DEN2感染对HUVEC自噬标记性蛋白LC3B表达的影响,激光共聚焦显微镜观察DEN2感染HUVEC自噬现象.结果:免疫组织化学法结果显示,细胞表达Ⅷ因子,符合HUVEC特点;接种DEN2后5～7dC6/36细胞出现肿胀、融合、产生空泡等典型的细胞病变,TCID50为10-5.6;随着感染DEN2量增加,HUVEC中DEN2 mRNA相对表达量呈上升趋势,在加入1×104TCID50病毒量时DEN2 mRNA相对表达量高(P＜0.05);用巴伐洛霉素A1 (Baf)抑制后,与未用Baf相比,相同TCID50 DEN2感染HUVEV后DEN2 mRNA表达减少(P＜0.05).Western-blot结果显示,与空白对照组比较,1×102、1×103、1×104TCID50 DEN2感染组LC3BⅡ/Ⅰ比值升高,LC3BⅡ、Ⅰ条带灰度值增加(P＜0.05);用Baf抑制后,与未用Baf相比,1×102、1 ×103、1×104TCID50DEN2感染组LC3BⅡ/Ⅰ比值上高,LC3BⅡ、Ⅰ条带灰度增加(P＜0.05).激光共聚焦扫描显微镜检测结果显示,在正常HUVEC胞浆内有LC3B(绿色荧光)及LAMP1(红色荧光),荧光融合后绿色、红色荧光重叠;用Baf抑制后,HUVEC胞浆内绿色红色荧光强度增加,荧光融合后绿色、红色荧光重叠部分减少;与正常HUVEC相比,1×104TCID50 DEN2感染组HUVEC胞浆内可观察到绿色、红色及橘黄色荧光(DEN2 NS1),绿色、红色荧光强度增加,在荧光融合后绿色、红色与橘黄色荧光重叠.结论:HUVEC在DEN2感染后24 h,随着感染量增加,病毒载量增加,加Baf抑制后DEN2增殖被抑制;DEN2感染HUVEC后,在胞浆内DEN2 NS1与LC3B、溶酶体标记蛋白LAMP1共定位;DEN2可诱导HUVEC白噬增强,Baf可抑制DEN2感染HUVEC白噬的发生.
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登革2型型内嵌合病毒全长cDNA克隆的构建
运用OL-PCR(Overlap PCR)方法,扩增出D2-04和D2-MON501结构蛋白区、5′非编码区等区域的嵌合片段,以此片段替换pDVWS501质粒中的相应部分后,转化DH5α菌.测序结果表明,已成功构建含有D2-04株完整的PrM和E基因、一部分C基因,及D2-MON501株非编码区、非结构蛋白区和大部分C基因的嵌合病毒全长cDNA(QH-04/MON501)克隆.为进一步研究登革2型病毒结构蛋白区对毒力的影响打下基础.
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昆虫杆状病毒系统表达登革2型病毒prM/E蛋白
目的：构建表达登革2型病毒prM/E蛋白的真核细胞系。方法：应用聚合酶链反应(PCR)方法从含有登革2型病毒prM/E基因的质粒中扩增得到prM/E基因。将该片段亚克隆到pGEM-T Easy载体上，用XhoⅠ和NheⅠ双酶切将其与同样双酶切的pFastBac Dual质粒连接，构建转移载体pFBD-prM/E。将转移载体转化的同时，含有杆状病毒穿梭载体Bacmid和Helper质粒的感受态DH10 Bac得到重组Bacmid；用后者转染Sf 9细胞获得重组杆状病毒。双酶切鉴定构建的重组杆状病毒转移载体pFBD-prM/E，间接免疫荧光法检测目的蛋白的表达。结果：通过间接免疫荧光法可观察到特异性绿色荧光，即检测到prM/E蛋白的表达。结论：利用昆虫杆状病毒系统成功表达了登革2型病毒prM/E蛋白，为登革病毒prM和E蛋白的功能研究、登革病毒感染的诊断以及登革病毒样颗粒疫苗的研制奠定了基础。
