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多重PCR-变性高效液相色谱快速检测单核细胞增生李斯特菌毒力基因方法的建立
目的 建立单增李斯特菌的多个靶基因快速检测手段,提高检测的准确性.方法 根据单增李斯特菌4个毒力基因(hly、prfA、inlA、inlB)设计引物,通过优化引物浓度和引物组合,进行多重PCR扩增,产物经变性高效液相色谱(DHPLC)进行快速检测.结果 出峰顺序依次为inlB、hly、inlA、prfA,扩增片段大小为146、210、255、388 bp,此方法具有良好的特异性,灵敏度可达到280 cfu/ml.结论 本方法可以满足实际工作中食品微生物检测的要求.
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多重聚合酶链反应在性病病原体鉴别中的应用
淋球菌(Ng)、沙眼衣原体(Ct)和解脲脲原体(Uu)所致疾病的主要临床表现非常相似,而治疗方案不尽相同.采用多重聚合酶链式反应进行病原体检测,978份标本均取自来本院就诊的性病怀疑者,其中男570例,年龄18～58岁,均取尿道拭子;女408例,年龄18～55岁,均取宫颈拭子.
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多重RT-PCR同时检测鉴别三种对虾病毒的研究与应用
根据基因库中对虾桃拉综合征病毒(TSV)、白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下和造血器官坏死病毒(I-HHNV)的基因序列,分别设计了三对特异性引物,通过对多重RT-PCR扩增条件的优化,研究建立了可同时检测鉴别TSV、WSSV和IHHNV的多重RT-PCR.该技术对同一样品中的TSV RNA、WSSV DNA和IHHNV DNA模板进行扩增,结果均同时得到3条大小与实验设计相符的231bp(TSV)、593bp(WSSV)和356bp(IHHNV)的特异性多重RT-PCR扩增带,对其它对虾病原核酸的扩增结果为阴性.敏感性试验结果表明,该技术低能检测到10pg TSV RNA、100pg WSSV DNA和100pg IHHNV DNA.临床检测试验结果表明,该技术对TSV、WSSV和IHHNV的检出率明显高于传统的临床症状观察和组织病理学检查,提示该技术适用于这三种病毒的临床快速检测和鉴别诊断.
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15个短串联重复序列在拉萨市和那曲地区藏族人群的多态性分布
目的 调查15个短串联重复序列(STR)(D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1PO、D3S1358、TH01、D13S317、D16S539、2S1338、D19S433、VWA、TPOX、D18S51、D5S818、FGA)在408名西藏拉萨市和那曲地区藏族人群中的基因型与等位基因频率分布. 方法 提取基因组DNA,利用多重PCR和五色荧光(6FAM、VIC、NED、PET、LIZ)自动化检测技术,获得基因分型图,然后进行统计分析,获得15个STR基因座在西藏拉萨市和那曲地区藏族群体中的基因型频率和等位基因频率,并作Hardy-Weinberg平衡检测及两地区基因频率的比较分析. 结果 在拉萨市藏族群体中,15个STR基因座分别检测到11～47种基因型,5～12种等位基因,那曲地区藏族群体中,分别检测到12～58种基因型,6～14种等位基因;15个STR基因座的等位基因频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡,拉萨和那曲地区藏族人群等位基因频率分布差异性较小. 结论 该15个STR在西藏拉萨市和那曲地区藏族群体中具有较高的遗传多态性,适合作为藏族群体的遗传标志,用于人类学、遗传疾病连锁分析、法医学亲子鉴定和个体识别等研究领域.
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多重聚合酶链式反应技术及其应用
标准的聚合酶链式反应是使用一对引物扩增一个特定的核酸序列,即单一引物对的PCR.但是在具体工作中有时需要同时对多个核酸序列进行扩增分析.显然,单引物对PCR要完成这类工作,需要耗费较多的时间和金钱.1988年,Chamberlain等[1]描述了一种多重聚合酶链式反应(multiplex polymerase chain reaction, M-PCR).
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7036例自然流产患者绒毛染色体异常的MLPA分析
目的 应用多重连接依赖式探针扩增(MLPA)技术分析胚胎停育及自然流产患者绒毛组织中常见的染色体非整倍体异常,为复发性自然流产、胚胎停育提供遗传病的病因资料.方法采用临床回顾性研究,对2013年11月至2016年10月在深圳市妇幼保健院就诊的7 036例胚胎停育或自然流产患者的绒毛或胎儿组织标本进行分析,所有标本均用树脂和蛋白酶K提取基因组DNA,应用MLPA技术检测染色体非整倍体异常,并用SPSS 17.0进行描述性和频数统计分析.结果7 036份流产组织标本中,染色体非整倍体异常共2 984份,占42.41%.其中异常比例高的前5位依次为:16三体(826份)11.74%、X0单体(401份)5.70%、22三体(247份)3.51%、13三体(149份)2.12%、21三体(144份)2.05%,19号和17号染色体非整倍体异常少见,分别有1份和3份,而1号染色体尚未发现非整倍体异常;部分三体和部分单体共161份(2.28%);单体中除X0比例高外,21单体较常见(17份,0.24%);双三体共56份(0.80%);三三体2份(0.03%);性染色体三体13份(0.18%);X0合并常染色体三体5份(0.07%);臂间不平衡易位15份(0.21%);非同源染色体间易位20份(0.28%).结论 三体和单体占绒毛染色体数目异常的绝大部分(90%以上),也是胚胎停育和自然流产的主要原因.同时利用MLPA可以全面、经济、快速地筛查出绒毛染色体非整倍体异常(即大片段的缺失或重复),从而进一步发现夫妇中可能存在的平衡易位携带者,为再次妊娠提供有价值的遗传信息.
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多重聚合酶链式反应在脓毒血症病原体检测中的应用
目的：探讨多重聚合酶链式反应（PCR）在脓毒血症病原体检测中的灵敏度、特异性及检测时间，为多重PCR在脓毒血症病原体检测中的应用提供理论依据。方法采用多重PCR和血培养检测医院40例脓毒血症患者血液中的病原体，并比较两种检测方法的灵敏度、特异性、检测速度、检测菌种的差异，并以同期40名健康体检者血标本作为对照；采用SPSS 15．0软件进行数据处理，检测阳性结果以率的形式表示，并进行χ2检验。结果对照组中两种方法的阳性率差异无统计学意义，脓毒血症组多重PCR检测的阳性率为55．0％，血培养为82．5％，两者比较差异有统计学意义（ P＜0．05），且血培养检测出18例脓血症患者中共有11例 PCR检测为阳性，占61．1％；多重PCR特异性为80．7％，灵敏度为95．7％；脓毒血症组多重PCR的平均检测时间为（6±0．56）h ，血培养法为（30．78±1．45）h ，差异有统计学意义（ P＜0．05）；从22份阳性血培养中共分离出4种病原菌，分别为金黄色葡萄球菌10株、铜绿假单胞菌7株、鲍氏不动杆菌3株、表皮葡萄球菌2株，多重PCR均能检测上述病原菌的DNA。结论在脓毒血症病原学的检测中，多重PCR较血培养具有更高的敏感性和特异性，检测时间也较血培养明显缩短，有利于脓毒血症病原体的快速检测，指导临床用药。
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应用多重连接依赖性探针扩增技术快速诊断遗传性压力敏感性周围神经病
目的 介绍多重连接依赖性探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)技术在遗传性压力敏感性周围神经病(hereditary neuropathy with liability to pressure palsies,HNPP)患者基因诊断中的应用.方法 应用MLPA技术检测8例临床拟诊为HNPP患者及5名健康对照者的周围髓鞘蛋白22(peripheral myelin protein 22,PMP22)基因、筑丝蛋白3基因及细胞色素c氧化酶组装蛋白10(cytochrome c oxidase assembly protein 10,COX10)基因外显子拷贝数.结果 7例临床拟诊的HNPP患者所检测的PMP22基因、筑丝蛋白3基因及COX10基因各外显子峰面积较健康对照明显减低,各基因的拷贝数为1,提示为大片段杂合缺失;另1例临床拟诊的HNPP患者所检测的PMP22基因、筑丝蛋白3基因及COX10基因峰面积正常,各基因拷贝数为2,未发现杂合缺失.结论 MLPA技术能快速、准确地对HNPP患者的HNPP相关基因进行定量分析,可用于HNPP患者的快速基因诊断.
关键词： 关节挛缩 遗传性感觉和运动神经病 多重聚合酶链式反应 -
致泻性大肠埃希菌毒力相关基因的检测和方法学分析
目的 分析5种致泻性大肠埃希菌(DEC)的毒力基因,建立一种快速检测与鉴定DEC的多重聚合酶链式反应(PCR).方法 采用多重PCR方法检测800份粪便标本中大肠埃希菌的毒力基因,对检测到毒力基因阳性的菌株进行DEC的归类,并对扩增结果进行测序验证.结果 800份粪便标本中分离DEC 46株(5.8％),其中肠致病性大肠埃希菌(EPEC)分离多22株,其次为肠产毒性大肠埃希菌(ETEC) 15株,肠聚集性大肠埃希菌(EaggEC)7株,肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)2株,无肠出血性大肠埃希菌(EHEC).结论 建立同时检测多个粪便标本的多重PCR方法,可敏感、快速地检测DEC.
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应用Xpert MTB/RIF对脊柱结核临床标本行结核分枝杆菌与利福平耐药性检测的验证性研究
目的 采用Xpert MTB/RIF系统对系列脊柱结核临床标本进行结核分枝杆菌检出与利福平耐药基因rpoB突变检测,初步验证该项技术的可行性与准确性.方法 自全军结核病研究所标本库中筛选140份脊柱结核临床标本,对标本行前处理后采用Xpert MTB/RIF系统进行结核分枝杆菌与利福平耐药基因rpoB的突变检测,以培养结果及表型药敏试验为金标准,判断Xpert MTB/RIF检测的敏感度、特异度、95％置信区间及检测耗时.结果 对临床确诊为脊柱结核的140份临床标本,Xpert MTB/RIF系统的结核分枝杆菌阳性检出率为63.57％ (89/140);在64份培养阳性标本中,XpertMTB/RIF检测结核分枝杆菌的敏感度为98.44％ (63/64);在76份培养阴性标本中,Xpert MTB/RIF检测结核分枝杆菌的敏感度为34.21％ (26/76).以表型药敏试验为金标准,采用Xpert MTB/RIF系统行利福平耐药性检测的敏感度为93.33％ (28/30),特异度为94.12％ (32/34).Xpert MTB/RIF系统平均检测耗时为2.1 h (1.8～2.6 h).结论 Xpert MTB/RIF是一种简便、快速、准确,且能够同时对脊柱结核临床标本行结核分枝杆菌检测与利福平耐药性检测的分子检测技术,具有潜在的临床应用价值.
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甲型血友病的基因诊断研究
目的 建立甲型血友病的基因诊断方法.方法 对33例甲型血友病患者以一期法检测血浆凝血因子FⅧ(F8)活性.采用长距离聚合酶链式反应扩增法(LD-PCR)进行FⅧ内含子22倒位检测,并对反应体系进行优化;聚合酶链式反应(PCR)技术检测内含子1倒位,凝胶成像技术分析扩增产物.捕获测序技术检测是否存在其他突变类型.结果 33例患者的FⅧ活性检测结果均小于1%,为重型;LD-PCR技术检测出13例患者存在Int22倒位,倒位发生率为39.4%;Int1倒位患者1人,发生率3%;对13例内含子 22倒位患者进行测序比对,未发现其他基因突变.结论 LD-PCR技术和多重PCR技术可以有效的检测重型甲型血友病FⅧ的基因倒位.
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16S rRNA基因及多重聚合酶链式反应在新生儿败血症早期诊断中的应用研究
目的 分析16S rRNA基因聚合酶链式反应(PCR)检测方法及血培养方法检测疑似新生儿败血症患儿血标本中潜在病原菌的病原学特点,并以此为基础建立一套适用于临床的可检测新生儿败血症常见菌株的特异性引物多重PCR体系.方法 建立16S rRNA通用引物PCR检测方法并检测534例疑似新生儿败血症患儿血标本,分析其病原学感染及特点,与常规血培养检测结果进行比较.建立适用于临床的可检测新生儿败血症常见菌株的特异性引物多重PCR体系.结果 534例血标本的血培养阳性率为26%,经鉴定为凝固酶阴性葡萄球菌(44.6%)、大肠埃希菌(14.4%)、无乳链球菌(8.6%)、金黄色葡萄球菌(7.9%)、肺炎克雷伯菌(5.8%)、屎肠球菌(4.3%)、其他菌株(14.4%).16S rRNA通用引物PCR检测阳性率为37.6%,显著高于血培养检测(P<0.05).经优化的多重PCR体系可快速准确检测败血症常见菌种.结论 16S rRNA基因PCR方法用于新生儿败血症的检测具有较高的检出率,可用于临床新生儿败血症的快速诊断.本研究初步建立的败血症常见致病菌特异性引物多重PCR体系具有一定的临床应用价值.
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保健食品中3种病原菌多重PCR快速检测方法的建立及验证
目的 建立快速检测保健食品中沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR(multiplex PCR,mPCR)方法,并进行验证及初步应用.方法 以提取的各菌株基因组DNA为模板,利用GenBank中登录的沙门菌invA、志贺菌ipaH、金黄色葡萄球菌nuc基因序列设计引物,采用优化后的反应体系及确定的反应条件进行PCR扩增,扩增产物经3％琼脂糖凝胶电泳鉴定,对建立的方法进行特异性、敏感性、重复性验证.将沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌等量混合后,进行10倍系列稀释,加至10批无病原菌蛋白质粉和10批无病原菌减肥茶样品匀浆中,用建立的方法进行PCR扩增,并与GB常规生化检测结果进行比较.结果 确定mPCR反应体系为:10×PCR buffer 2.0μl,dNTPs 2.5μl,Taq DNA酶0.6μl,上下游引物各1.5μl,Mg2+1.0μl,补加ddH2O至25μl.10株细菌中,沙门菌、2株志贺菌、金黄色葡萄球菌扩增结果为阳性,其他菌株为阴性,invA、ipaH、nuc基因扩增片段与GenBank登录的序列同源性分别为99％、99％和100％;沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌菌株均能在101～ 105 CFU/ml浓度时扩增出特异性目的条带;5个浓度混合菌液扩增产物均可见特异性反应条带.该方法扩增出10批人工添加细菌蛋白质粉和10批人工添加细菌减肥茶中沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌的特异性基因片段,检出限均为102 CFU/ml,与GB常规生化检测结果一致.结论 建立的保健食品中沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌mPCR检测方法特异性强,灵敏度高,重复性好,可满足不同检验机构快速、准确检测保健食品中多种病原微生物样品的实际需要.
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基于多重聚合酶链式反应方法的鼠疫耶尔森菌差异区段分型技术的建立与应用
目的 利用多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法,扩增鼠疫耶尔森菌(简称鼠疫菌)DNA中的差异区段(different region,DFR),探讨建立鼠疫菌多重DFR分型技术的可行性.方法 根据鼠疫菌23个DFR及pMT质粒的靶标产物长度,将24对引物进行优化组合,通过不同的组合在一个PCR反应体系中加入多对引物,针对已知阳性DNA模板扩增出多个目的片段.并将200株野生鼠疫菌DNA经多重PCR和普通PCR扩增,验证这两种方法的符合率.结果 用已知阳性DNA模板扩增出24个目的片段.通过不同的排列组合,将24对引物优化组合出9个组.通过200株野生鼠疫菌DNA验证多重PCR和普通PCR的符合率为100％.结论 利用多重PCR方法对鼠疫菌DNA中的DFR进行分型是可行的,应用该方法能为大批量鼠疫菌DFR分型鉴定提供高效、经济且准确率高的实验手段.
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辽宁省汉族人群15个短联重复序列基因座的遗传多态性
目的:获得15个短串联重复序列(Short tandem repeat, STR)基因座在辽宁地区汉族人群的等位基因频率分布及群体遗传学数据.方法:调查15个STR(D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1PO、D3S1358、TH01、D13S317、D16S539、2S1338、D19S433、VWA、TPOX、D18S51、D5S818、FGA)在141名辽宁汉族人群中等位基因频率分布.提取基因组DNA,利用多重PCR和五色荧光(6FAM、VIC、NED、PET、LIZ)自动化检测技术,获得基因分型图,然后进行统计分析,获得15个STR基因座等位基因频率及群体遗传学指标.结果:15个STP在辽宁地区汉族人群中具有较高的遗传多态性,15个STR基因座分别检测到5～16种等位基因,共136个,频率分布在0.0035～0.5248之间,DP值在0.7896～0.9528之间,H值在0.6225～0.8534之间,PIC值在0.6140～0.8480之间,EPP值在0.4324～0.8281之间,累积个体鉴别力为0.99999999,累积非父排除率为0.99999999.结论:15个STR位点适合作为辽宁地区汉族人群的遗传标记,用于人类学、疾病连锁分析、法医学亲子鉴定和个体识别等领域的研究.
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痰液耐甲氧西林金黄色葡萄球菌快速检测及其临床应用
目的:评估免疫磁珠富集联合多重聚合酶链式反应(multiple polymerase chain reaction,MPCR)技术检测痰液耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA)快速检测及其临床应用.方法:利用免疫磁珠特异性富集金黄色葡萄球菌,联合MPCR技术直接检测痰液标本中MRSA,并以常规细菌培养+Vitek-2全自动微生物分析仪法为标准,评价免疫富集联合MPCR检测的敏感性、特异性.结果:全自动微生物分析仪共在神经外科痰液标本中检出MRSA 21株,总检测率为10.5%,实验耗时48~72 h,检测费用约120元;免疫磁珠富集联合MPCR法共在痰液标本中检出MRSA 24株,检出率12.0%,敏感性100.0%,特异性98.3%,检测耗时降至4~6 h.结论:免疫磁珠联合MPCR法可以直接检测神经外科患者痰液标本中的MRSA,具有敏感、特异、快速等优点,有助于院内MRSA感染的诊断与防控.
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不同荧光定量PCR技术在乙型肝炎病毒检测中的应用评价
目的：评价普通荧光定量 PCR 技术与罗氏内标法荧光定量 PCR 技术在乙型肝炎病毒（HBV）检测中的意义。方法采集 HBV 患者的血清190份，分别用两种方法进行检测，通过相关性分析和 Kappa 检验评价两种试剂检测结果之间的差异性及一致性。结果（1）190份标本中，罗氏 Cobas 试剂与国产试剂检测结果呈线性相关（R2＝0．6707，P ＜0．05）；（2）分成 HBeAg （＋）与 HBeAg（－）两组比较，两组中 Cobas 试剂与国产试剂检测均呈线性相关（R2＝0．5864，P ＜0．05；R2＝0．5226，P ＜0．05）；（3）根据不同 HBeAg 状态和抗病毒要求的 DNA 载量对标本进行一致性分析，HBeAg（＋）组 Kappa 值为0．752；HBeAg （－）组 Kappa 值为0．381。结论对于 HBeAg（＋）患者，可以应用国产试剂检测患者的 HBV-DNA 水平，而对于 HBeAg（－）患者，建议应用 Cobas 试剂检测其患者的 HBV-DNA 水平。
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直接从粪便中检测致犊牛腹泻产肠毒素大肠杆菌的双重PCR方法的建立与应用
目的产肠毒素大肠杆菌(Enterototxigenic, Escherichia Coli, ETEC)是造成人和动物腹泻的主要病原之一,也是造成新生乳用犊牛腹泻的主要原因,一株ETEC可能产生一种或者多种肠毒素.根据产肠毒素大肠杆菌产生的两种主要毒素的基因序列,设计了两对引物,建立多重PCR方法.该方法仅用4.5小时即可检测出导致犊牛腹泻的产肠毒素大肠杆菌菌株,具有敏感度高、特异性强和检测速度快等特点.本试验的目的是用所建立的多重PCR方法来确定ETEC在导致犊牛腹泻中的作用.采用该方法对乳用犊牛的203个腹泻样品进行了检测,结果,用传统的分离培养方法得到的203株典型大肠杆菌中有135株为ETEC;其中LT阳性为105株,ST阳性为126株,LT+ST阳性的为96株,阳性率为66.5%.而采用直接从粪样中提取PCR模板的方法进行PCR,检测到146个犊牛粪样为ETEC阳性,其中LT阳性为112株,ST阳性为137株,LT+ST阳性为103株,阳性率为71.9%,明显高于传统的检测方法;并且所检测到的146个ETEC阳性的犊牛粪样完全包含用传统的分离培养方法得到的135个阳性粪样,且基因分型结果相同.
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多重聚合酶链式反应检测C、D型肉毒神经毒素基因
目的为了建立检测C、D型肉毒神经素基因的PCR方法.方法用人工合成的两对寡核苷酸引物于同一反应管中扩增C、D型肉毒素基因的一段DNA片断,建立了用于C、D型肉毒神经毒素基因检测的多重PCR方法.用多重聚合酶链式反应对梭状芽胞杆菌属的10种26株菌进行了鉴定,并对其特异性及灵敏度进行了检查.结果当样本中同时含有C、D型的模板DNA时用该PCR系统可同时扩增出C、D型的目的片段,分别为999bp和404bp,其它各型肉毒酸梭菌及其它梭菌均为阴性,灵敏度较C、D型分别扩增偏低,C型为450pg,D型为10pg.结论该PCR系统可用于C、D型肉毒梭菌的鉴定、定型.
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3种食源性致病菌的多重PCR快速检测方法研究
目的 建立一种能同时检测志贺菌,副溶血性弧菌和大肠埃希菌O157的多重PCR方法.方法 根据志贺菌IpaH基因[1]、副溶血性弧菌t1基因[2]、大肠埃希菌O157 eaeA基因[3,4]设计特异性引物,采用LB对志贺菌,副溶血性弧菌和大肠埃希菌O157进行振荡培养,通过多重PCR扩增3种病原菌的目的基因,通过优化反应体系,提高反应的检测效率和特异性.结果 对志贺菌,副溶血性弧菌和大肠埃希菌O157振荡培10h,经过PCR反应扩增出目的基因,把志贺菌,副溶血性弧菌、大肠埃希菌O157、肠道致病性大肠埃希菌,产肠毒素性大肠埃希菌,金黄色葡萄球菌,单核细胞增生李斯特菌、蜡样芽胞杆菌8种菌混在一起提取核酸进行PCR扩增,结果表明此PCR方法具有良好的特异性.结论 本研究建立的多重PCR检测方法能快速检测志贺菌,副溶血性弧菌和大肠埃希菌O157,具有快速,灵敏,特异的特点,能广泛应用于食源性疾病检测,食物中毒检测等领域.
