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鲍曼不动杆菌临床分离株分子生物学鉴定分析
目的 了解目前鲍曼不动杆菌临床鉴定分析的准确性及可能存在的问题.方法 本研究随机抽取100株临床鉴定为鲍曼不动杆菌的临床分离鉴定株开展了扩增核糖体DNA限制酶切分析,16S rRNA编码基闪及16S～23S rRNA间区测序鉴定分析.结果 鉴定出5个不动杆菌种,分别为鲍曼不动杆菌(77%),菌种3(9%),菌种10(6%),菌种13TU(3%),琼氏不动杆菌(2%),还有3%为非不动杆菌.结论 目前临床实验室对鲍曼不动杆菌的鉴定准确性较低,可能影响对不动杆菌不同种的流行病学特征和临床状况的认知,临床不动杆菌的鉴定能力有待加强.
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椰酵假单胞菌与唐菖蒲伯克霍尔德菌16S～23S rRNA基因间区序列的比较研究
目的 研究比较我国分离的椰酵假单胞菌与唐菖蒲伯克霍尔德菌不同致病型菌株的16S～23S rRNA基因间区序列,分析不同菌株基因水平的差别,并阐述其系统发育关系.方法设计2对伯克霍尔德菌属特异引物,扩增16S～23S rRNA基因间区序列.应用分子生物学软件,对3株分别代表唐菖蒲伯克霍尔德菌3种不同致病型的国际参考菌株(ATCC10248、NCPPB 947、NCPPB3580)、1株伯克霍尔德菌属B.phenazinium种代表株(LMG2247)及8株从我国不同地域、不同食物样品中分离的椰酵假单胞菌(HN2y、Co14、Co8、Co36、Sx8801、90-3、56(2)、56(2))的16S～23S rRNA基因序列进行测定,并与核酸数据库(GenBank)中相关菌株序列进行比较分析.结果通过不同菌株16S～23S rRNA间区序列的分析比较,发现分离的椰酵假单胞菌米酵菌酸产毒株存在2个序列高可变区及特异基因序列,阐述了我国椰酵假单胞菌与唐菖蒲伯克霍尔德菌的系统发育关系,将DNA测序结果在核酸数据库中注册,并绘制了系统发育进化树.结论该研究结果为进一步鉴定椰酵假单胞菌米酵菌酸产毒株,从分子水平探讨其产毒机制及系统发育关系提供了新的、可靠的理论依据和技术支撑.
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人工耳蜗植入者线粒体12S rRNA基因突变的分析
目的 研究接受人工耳蜗植入的耳聋患者中,线粒体12SrRNA基因突变的类型和发生概率.方法 选取100例接受人工耳蜗植入的非综合征性耳聋患者(语前聋96例,语后聋4例;氨基糖苷类药物使用史者16例),取外周血提取基因组DNA,以PCR方法扩增线粒体12S rRNA基因,扩增产物纯化后直接测序分析突变.结果 100例患者中有2例检测到线粒体12S rRNA基因1555AG纯合突变,1例检测到delT961Cn杂合突变,致病基因突变总检出率为3%.结论 在所研究的人工耳蜗植入群体中,线粒体12S rRNA基因突变不是主要的致聋病因.
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从耐药肺炎克雷伯菌中检出aac(6′)-Ib基因新亚型
为深入了解一组分离自浙江省杭州地区和湖州地区耐药肺炎克雷伯菌之氨基糖苷类药物耐药的遗传学背景,我们同时检测了47株耐药肺炎克雷伯菌的15种氨基糖苷类修饰酶和6种16S rRNA甲基化酶基因.现报道如下.
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NOB1基因研究进展
NOB1[NIN1/RPN12 binding protein 1 homolog (S.cerevisiae)]是一个多功能的蛋白质,它不仅和19S 核糖体调节亚基的组分结合而且在20S 蛋白酶体成熟过程中也发挥重要作用.同时NOB1 还参与核糖体合成,NOB1 和20S 前体rRNA 结合,NOB1 缺失导致18S rRNA 不能合成,20S 前体rRNA 堆集.因此,NOB1 表达发生改变,会直接影响核糖体和蛋白酶体的生物合成,而核糖体和蛋白酶体发生改变,与肿瘤的发生、发展、转移和肿瘤抑制有关.基于这层关系,我们认为NOB1 在肿瘤治疗方面也将发挥重要的作用.现将NOB1 基因的研究进展综述如下.
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从尿液中分离出aac(6')-Ib基因新亚型的大肠埃希菌
迄今为止,已发现的细菌对氨基糖苷类抗菌药物产生的耐药机制主要有5种,其中由获得性耐药基因介导的耐药机制有2种,即产生氨基糖苷类修饰酶(AMEs)和产16S rRNA甲基化酶.
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细菌16S-23S rRNA 基因特异DNA图谱的分子诊断
目的应用聚合酶链反应(PCR)、限制性内切酶片段长度多态性分析(RFLP)及测序技术,建立检测不同属种细菌的 16S-23SrRNA基因区间的特异图谱.方法对临床上常见的细菌进行PCR扩增、RFLP、分子克隆及序列分析,同时对临床标本进行培养与PCR-RFLP比较.结果 27株不同细菌行PCR扩增后,得到不同DNA 图谱.其中15种细菌经PCR扩增即可区分,另10种经Hinf I或Alu I 酶切后才能区分.肺炎克雷伯菌与坚韧肠球菌的差异只在第779位碱基上不同,Xma III酶能区别.42例临床诊断为新生儿败血症者,15例培养阳性,阳性率35.7%;而PCR阳性者则为27例,阳性率为64.29%,明显高于血培养(P<0.01).6例脑脊液标本中,1例PCR及培养均阳性(表皮葡萄球菌);2例培养阴性标本,其PCR也阳性;经图谱分析为葡萄球菌,1例培养为新型隐球菌的脑脊液标本PCR检测为阴性.另2例PCR及培养均阴性.结论建立了PCR-RFLP技术快速检测细菌16S-23S rRNA基因区间的方法,具有特异、敏感、快速、准确的特点,为临床细菌感染的病原诊断提供新的科学依据.
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低氧状态下Apak对rRNA转录的调控
目的 探讨低氧状态下Kruppel相关盒(KRAB)型锌指蛋白Apak对核糖体RNA(rRNA)转录影响变化及机制.方法 利用实时定量PCR检测低氧状态下rRNA转录水平的变化及Apak对rRNA转录水平的影响,Western印迹检测蛋白的表达,间接免疫荧光观察低氧状态下Apak的定位变化.结果 在低氧(0.3%O2)处理24 h内,野生型HCT116细胞rRNA表达水平呈现先高后低的变化,而在Apak敲除的HCT116细胞系中,低氧处理后rRNA转录水平持续下降;低氧处理3 h后,Apak对rRNA转录的抑制能力消失,Apak的蛋白水平和磷酸化水平降低,在细胞核仁中的定位消失.结论 低氧处理后Apak对rRNA转录抑制能力的消失促使rRNA转录水平的暂时升高.
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靶向RNA:非药靶标研究的新机遇
制药产业历来一直注重发现以基因产物蛋白质为靶标的化合物,而对RNA组成的基因与蛋白质的中间产物研究甚少.以细菌rRNA为靶标的少数几种药用于临床已有半个多世纪.其中,以人类rRNA为靶标的氨基糖苷类抗生素在遗传病治疗方面已有所发展.RNA靶标是表达非药用蛋白质的经济方法,这是多年来积累的生物学知识为基础发展起来的高通量筛选方法所不能做到的.以非编码RNA序列为靶标的研究为药物发展提供了全新的机遇.本文介绍了靶向RNA的分类、特点及其在药物发现中的研究现状.
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rRNA扩增直接检测艾滋和结核共感染的结核分枝杆菌的初步研究
目的 建立一种快速、准确、简便的检测结核分枝杆菌的方法.方法 应用间接转录扩增技术,以结核分枝杆菌特异性rRNA为扩增目标,扩增片段被特异性DNA探针结合(杂交),再经杂交保护分析法筛选,后以化学发光仪检测被标记的rRNA.用该法检测62例临床标本.结果 62 例艾滋合并结核患者痰标本检出阳性9例.结论 rRNA扩增直接检测结核分枝杆菌方法作为结核病诊断的一项新的分子生物学检测方法,具有重要的临床应用价值.
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前列腺组织中细菌16S rRNA基因、IL-1β、TNF-α和IgA的表达及意义
目的 探讨细菌在慢性前列腺炎(CP)中的致病作用.方法 前列腺标本取自2002-2008年192例猝死于非前列腺疾病的器官捐献者,年龄20～38岁.取周围带组织并分两块,一块前列腺组织行病理检查及白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、免疫球蛋白A(IgA)的免疫组化分析;另一块行细菌16S rRNA基因(16S rDNA)PCR分析.结果 33.3%(64/192)的前列腺组织病理呈CP改变.细菌16S rDNA总阳性率为19.8%(38/192),而在CP标本中16S rDNA阳性率为50.0%(32/64),非CP标本中16S rDNA阳性率为4.6%(6/128),CP组16S rDNA阳性率高于非CP组(x2=55.185,P<0.001).IL-1β、TNF-α和IgA的表达在CP组中明显高于非CP标本(P<0.01),且三者表达呈正相关(P<0.01);在64例CP组织标本中,16S rDNA阳性者IL-1β、TNF-α和IgA的表达明显高于16S rDNA阴性者(P<0.01).结论 前列腺组织中细菌16S rDNA、细胞因子和免疫球蛋白A的表达增加和前列腺组织病理炎症改变相关,提示细菌感染可能是CP的重要病因.
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螺杆菌感染与原发性肝癌的相关性研究
目的探讨螺杆菌感染与人类原发性肝癌(PLC)的相关性.方法选取21例PLC患者的肝癌组织为研究对象(实验组),12例非肝癌手术患者的肝组织作对照组.参照文献设计螺杆菌属细菌16SrRNA基因特异性引物,进行聚合酶链反应(PCR)扩增,扩增产物经Southern杂交证实,并将PCR产物进行测序及同源性比较.同时,将两组标本制成病理切片用于螺杆菌属的cDNA-mRNA原位杂交实验.通过定性和定位测定评价肝组织螺杆菌感染与PLC的相关性.结果实验组62%(13/21)的肝癌组织中检出螺杆菌属16SrRNA存在,而对照组无阳性检出(P<0.01).所有PCR产物经Southern杂交得到证实.利用原位杂交技术检测实验组和对照组标本螺杆菌属16SrRNA-mRNA,实验组有13例阳性,对照组均为阴性(P<0.01).比较显示,肝癌组织中的螺杆菌属16SrRNA序列与幽门螺杆菌的16SrRNA序列有97.80%的同源性.结论 PLC患者肝组织中可能存在螺杆菌属感染且感染率较高,提示螺杆菌感染与PLC的发生可能存在某种相关性.
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肺炎支原体的耐药现状
肺炎支原体(MP)是儿童和青少年呼吸道感染的重要病原体,大环内酯类抗生素是治疗儿童或青少年MP感染的首选药物,然而,近年来世界范围内出现了MP对大环内酯类抗生素的耐药现象,尤其是亚洲、欧洲和美国.23S rRNA结构域Ⅴ区的点突变是引起MP耐药的主要机制.
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16S rRNA基因及多重聚合酶链式反应在新生儿败血症早期诊断中的应用研究
目的 分析16S rRNA基因聚合酶链式反应(PCR)检测方法及血培养方法检测疑似新生儿败血症患儿血标本中潜在病原菌的病原学特点,并以此为基础建立一套适用于临床的可检测新生儿败血症常见菌株的特异性引物多重PCR体系.方法 建立16S rRNA通用引物PCR检测方法并检测534例疑似新生儿败血症患儿血标本,分析其病原学感染及特点,与常规血培养检测结果进行比较.建立适用于临床的可检测新生儿败血症常见菌株的特异性引物多重PCR体系.结果 534例血标本的血培养阳性率为26%,经鉴定为凝固酶阴性葡萄球菌(44.6%)、大肠埃希菌(14.4%)、无乳链球菌(8.6%)、金黄色葡萄球菌(7.9%)、肺炎克雷伯菌(5.8%)、屎肠球菌(4.3%)、其他菌株(14.4%).16S rRNA通用引物PCR检测阳性率为37.6%,显著高于血培养检测(P<0.05).经优化的多重PCR体系可快速准确检测败血症常见菌种.结论 16S rRNA基因PCR方法用于新生儿败血症的检测具有较高的检出率,可用于临床新生儿败血症的快速诊断.本研究初步建立的败血症常见致病菌特异性引物多重PCR体系具有一定的临床应用价值.
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系统化细菌鉴定方法的探索及其启示
细菌鉴定有着悠久的历史.随着现代科学技术的快速发展,许多新方法、新技术在细菌鉴定中广泛应用,大大提高了鉴定水平.细菌鉴定技术的发展历程,引发我们探索系统化细菌鉴定的新方法,并带给我们对认识事物、看待问题、进行科学思维、继承与创新等方面的哲学思考.
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原发性肝癌组织中螺杆菌属16S rRNA基因的检测及意义
目的 探讨原发性肝癌(HCC)组织中螺杆菌感染情况.方法 选取经病理诊断的28例HCC患者的肝癌组织为实验组,22例非肝癌肝病患者肝组织和25例胃癌患者胃癌组织作对照组.采用聚合酶链反应(PCR)扩增螺杆菌属16S rRNA基因、幽门螺杆菌相关功能基因空泡毒素基因(vacA)和细胞毒素相关基因(cagA),16S rRNA的扩增产物经Southern杂交确认,并将PCR产物进行测序及同源性比较.结果 28例HCC标本中有17例检出螺杆菌属16S rRNA基因,阳性率为60.7%;25例胃癌标本有18例检出螺杆菌16S rRNA,阳性率为72.0%;其他肝病组未扩增出16SrRNA基因.16S rRNA PCR产物经Southern杂交证实为幽门螺杆菌.序列测定表明,肝癌和胃癌组织中的螺杆菌16S rRNA序列与幽门螺杆菌序列有97.8%的同源性.肝癌组相关功能基因有3例cagA基因阳性,胃癌组有2例cagA基因阳性,均未扩增出vacA基因.提示,幽门螺杆菌菌株的基因型多为Ⅱ型,而少数为Ⅰ型.结论 HCC患者肝组织中存在螺杆菌感染且感染率较高.螺杆菌感染与HCC可能存在相关性.
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16S rRNA基因检测及在自发性细菌性腹膜炎诊断中的应用
自发性细菌性腹膜炎(SBP)是失代偿期肝硬化常见的严重并发症,及时、正确的诊断并使用抗生素治疗是降低患者病死率的关键.腹膜炎时,传统的腹水细菌学检查所需时间长、费用高、操作繁琐,且敏感度低.当前,应用分子诊断技术,通过检测细菌DNA以诊断感染性疾病和鉴定致病菌正被广泛地运用于临床.此文就目前常用的检测靶分子-细菌核糖体16S小亚基(16S rRNA)在SBP诊断中的应用进展进行概述.
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病原菌23S rRNA基因序列变异性分析
目的研究常见病原菌23S rRNA基因序列变异规律,为细菌鉴别诊断和相关研究提供科学依据.方法运用Genbank信息和生物学分析软件,并通过PCR扩增23S rRNA基因片段,分析不同种属细菌23S rRNA基因的保守序列、变异规律及菌株间种系进化关系.结果通过基因扩增和生物信息学比较分析,获得21个23S rRNA的通用保守序列,23S rRNA基因保守序列与变异区在种系间呈间隔分布,大量变异区呈"马赛克"式分布.种系间进化关系与16S rRNA分析结果一致.结论23S rRNA基因序列变异规律为进行细菌的鉴别诊断提供了重要的理论基础.
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编码日本血吸虫线粒体大亚基核糖体基因的亚克隆、测序及同源性分析
目的筛选日本血吸虫成虫cDNA文库,得到基因克隆并测序.方法体外将以阳性克隆为模板的PCR产物和pGEM-T载体连接,转染大肠杆菌XL1-blue,经抗生素及生色底物X-gal初筛,再用限制性内切酶酶切法进一步鉴定为重组质粒后,DNA自动测序仪测序.序列送blast基因服务站进行同源性分析.结果构建三个含日本血吸虫cDNA基因片段的重组子,其中一个阳性克隆序列为编码日本血吸虫线粒体大亚基核糖体的基因序列.结论获得编码日本血吸虫线粒体大亚基核糖基因片段,为分析其作为候选重组疫苗分子的潜能打下基础.
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贵州省2011年黑线姬鼠钩端螺旋体分离株16S rRNA基因序列分析及基因种鉴定
目的 了解贵州省钩端螺旋体病(简称钩体)病原学特征,分析2011年贵州省钩体病疫区黑线姬鼠钩体分离株16S RNA基因序列并对其进行基因种鉴定,为贵州省钩体病的有效预防和控制提供科学依据.方法 应用PCR扩增几乎全长的钩体16S rRNA基因片段,并将扩增产物进行双向序列测定,从NCBI数据库下载钩体17个基因种代表菌株及伊尼利螺旋体和短小螺旋体16S rRNA基因序列,采用生物信息软件比较分离株和各基因种代表株间的核苷酸序列,分析其亲缘进化关系,确定分离株基因种.结果 通过PCR扩增和基因测序技术获得4株钩体分离株16S rRNA基因核苷酸序列(1492 bp),4株钩体分离株的核苷酸同源性为100%,与17个钩体基因种中的问号钩体(L.interrogans)基因种黄疸出血群代表菌株的同源性高(99.9%),系统进化树分析显示,钩体分离株与17个基因种代表菌株及伊尼利螺旋体和短小螺旋体形成致病性、非致病性、未知致病性和其它分支,贵州4株分离株分属于致病性基因种分支,其中与致病性钩体8个基因种中的问号钩体基因种亲缘关系近.结论 贵州省2011年钩体病疫区黑线姬鼠钩体分离株均属致病性钩体的L.interrogans 基因种,该基因种菌株可能为当地流行菌株,该结果 将为贵州省钩体病的预防和控制提供科学依据.
