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低氧状态下Apak对rRNA转录的调控
目的 探讨低氧状态下Kruppel相关盒(KRAB)型锌指蛋白Apak对核糖体RNA(rRNA)转录影响变化及机制.方法 利用实时定量PCR检测低氧状态下rRNA转录水平的变化及Apak对rRNA转录水平的影响,Western印迹检测蛋白的表达,间接免疫荧光观察低氧状态下Apak的定位变化.结果 在低氧(0.3%O2)处理24 h内,野生型HCT116细胞rRNA表达水平呈现先高后低的变化,而在Apak敲除的HCT116细胞系中,低氧处理后rRNA转录水平持续下降;低氧处理3 h后,Apak对rRNA转录的抑制能力消失,Apak的蛋白水平和磷酸化水平降低,在细胞核仁中的定位消失.结论 低氧处理后Apak对rRNA转录抑制能力的消失促使rRNA转录水平的暂时升高.
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Apak稳定敲除细胞系的建立及其p53活性和凋亡水平的变化
目的：利用CRISPR／Cas9慢病毒系统在人结肠癌细胞（ HCT116细胞）中建立稳定及永久性Apak敲除细胞系，检测Apak敲除后细胞部分生物学活性、p53活性和凋亡水平的变化。方法构建lentiCRISPR v2－sgRNA Apak敲除质粒，进行慢病毒包装，感染HCT116细胞，嘌罗霉素筛选出阳性克隆。通过蛋白质免疫印迹检测Apak蛋白水平，筛选得到Apak稳定敲除细胞系。分别通过报告基因实验、流式细胞术和克隆形成实验测定Apak稳定敲除细胞系中p53活性、细胞凋亡率和克隆形成能力。结果通过测序证明lentiCRISPR v2－sgRNA Apak敲除质粒正确，蛋白质免疫印迹证实Apak敲除细胞系中Apak表达缺失。在Apak敲除细胞系中p53的转录活性增强，Apak敲除细胞凋亡增加、克隆形成能力降低。结论获得Apak稳定敲除细胞系，便于后期Apak功能的研究。
