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Blast-病毒物种鉴定的新方法
采集自愿献血员中56份HCV-Ab阳性血样,常规分离血清,应用RT-nPCR对HGV-NS3区进行核酸扩增,PCR扩增产物与PMD18-T载体连接,转染DH5d工程菌株,挑选白色菌落,经内套PCR验证克隆阳性者,以碱裂解法提取质粒DNA,应用荧光染料Big Dye标记、Sanger双脱氧末端终止法进行重组DNA的核酸序列测定.将测得的核酸序列,经国际互联网络输入到NCBI的GenBank数据库的局部序列相似形查询(Blast)的查询框中,借助于GenBank数据库中的资料和计算机分析程序中的BlastN软件,与数据库中所有已知的核酸序列进行序列同源性比对搜索分析.
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新型重组免疫抑制融合毒素蛋白B7-2-PE40KDEL的表达优化
目的:我们所研创的pRSETa-B7-2-PE40KDEL/BL21 pLysE工程菌通常情况下更多的是以包涵体形式为主,而少部分为可溶形式,本研究试图在不改变其结构而仅通过优化各种已知影响原核表达系统的相关因素而获得稳定、高效的几乎全部以可溶性形式表达的重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白.方法:针对更换不同的培养基、降低或升高诱导温度、增加或减少IPTG的用量、延长或缩短诱导时间等诸多能够增加可溶性表达量的各种因素进行较为系统的探索.结果:该工程菌在无压力选择条件下传代50代后的表达稳定性约为60%;通过大量对比研究,我们终确定了pRSETa-B7-2-PE40KDEL/BL21 pLysE菌种的佳培养诱导表达方案:即过夜活化的菌种以2%浓度接种于2YT培养基,22℃培养至D值约为0.4时加入0.1 mmol/L IPTG,诱导12 h,由此可获得较高水平的、稳定的、几乎全部为可溶性表达的重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白,目的蛋白量占菌体总蛋白的≥24%.结论:通过优化各种已知影响原核表达系统的相关因素,获得了稳定、高效的几乎全部以可溶性形式表达的重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白的工程菌,为进一步有效分离纯化该蛋白奠定了基础.
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基因重组丁型肝炎病毒抗原的制备与检测
丁型肝炎病毒是一种缺陷性RNA病毒,其感染发病需在乙型肝炎病毒(HBV)存在时才能发生[1],这种重叠性感染通常导致暴发性肝炎、进行性慢性活动性肝炎及肝硬化[2].采用HDV感染实验动物,提取HDV抗原制备诊断HDV试剂盒[3,4],方法复杂,周期长,实验动物进口不便.为解决HDVAg的来源,我们构建了表达HDV的大肠杆菌工程菌株.