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透明质酸复合BMP-2转染的兔骨髓基质干细胞在裸鼠肌内成骨的实验研究
我们通过动物实验,对高分子量透明质酸(hyaluronic acid, HA)复合腺病毒介导的人骨形态发生蛋白-2基因(Adv-hBMP-2)体外转染兔骨髓基质干细胞(BMSCs)裸鼠肌内成骨与成软骨能力进行了观察.
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342bp人骨形态发生蛋白2成熟肽基因的克隆表达
目的 探讨克隆人骨形态发生蛋白2(hBMP2)成熟肽的精简的基因序列并原核表达方法.方法 剔除所有信号肽和中间前肽的非必需基因序列,以RT-PCR方法克隆扩增出hBMP2的342bp的成熟肽基因片段,将其与原核表达载体PBV220酶切后相连接并测序,构建PBV220-hBMP2的真核基因原核表达系统,在DH5α大肠杆菌下扩增并温度诱导表达hBMP2蛋白质,SDS-PAGE检测表达蛋白.结果 RT-PCR扩增出hBMP2的成熟肽基因342bp片段与Genbank公布的序列完全一致,且经DNA电泳和蛋白电泳鉴定,构建PBV220-hBMP2原核表达系统可导入DH5α大肠杆菌,并在温度诱导下表达出约16kD的蛋白条带,诱导培养4h后的蛋白表达量达到高峰.结论 成功扩增342bp的成熟肽hBMP2基因片段能在原核大肠杆菌上有效表达生产hBMP2蛋白质.
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自制人骨形态发生蛋白2复合骨修复材料诱导骨再生
背景:骨形态发生蛋白是目前发现的一类惟一可独立诱导骨再生的细胞因子,临床应用前景广阔.但它们价格昂贵,限制了在中国的应用.目的:探讨自主生产的重组人骨形态发生蛋白2的骨诱导活性及对骨缺损的修复作用.方法:通过电泳及质谱的方法检测其复性后重组人骨形态发生蛋白2的纯度,通过C2C12细胞在重组人骨形态发生蛋白2诱导下向成骨细胞分化检测其骨诱导活性.将重组人骨形态发生蛋白2与以动物骨为原料加工制成的新型骨修复材料复合,植入新西兰兔桡骨缺损实验模型观察其对骨缺损的修复作用.结果与结论:自主生产的重组人骨形态发生蛋白2纯度≥95%,能明显诱导C2C12细胞向成骨细胞分化,分化早期大量表达碱性磷酸酶,分化末期形成大量的矿化小节,诱骨活性良好.在兔桡骨修复试验中,X射线影像学及苏木精-伊红染色组织学检查结果表明,重组人骨形态发生蛋白2复合材料组在2个月时形成大量骨痂,4-6个月时载体与自体骨融合,材料大量降解,修复效果良好;单纯骨填充材料组4-6个月时只有少量新生骨桥与自体骨连接,降解量极少;空白对照组损伤部位为纤维化组织所填充.结果提示自主生产的重组人骨形态发生蛋白2促进骨修复作用明显,适合应用于临床.
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重组人骨形态发生蛋白2人工骨复合物在腰椎横突间植骨融合中的作用
背景:重组人骨形态发生蛋白2(recombinant human bone morphorgenetic protein-2,rhBMP-2)具有较强的成骨诱导活性,但单纯BMP-2在体内易被蛋白酶所降解,其诱导活性也难以得到充分发挥.近研究表明20%β-磷酸三钙,消旋聚乳酸(β-tricalcium phosphate/poly-(D,L-lactic acid),β-TCP/PDLLA)在结构上符合骨的生物学特点,已能达到和皮质骨相似的强度,具有良好骨传导能力,又能作为rhBMP-2的良好载体.目的:观察rhBMP-2/20%β-TCP/PDLLA复合物促进兔腰椎横突间植骨融合模型愈合的情况.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-05/2008-12在桂林医学院中心实验室完成.材料:采用浇铸盐析技术制备三维多孔20%β0-CP/PDLLA,然后与rhBMP-2复合,制成rhBMP-2/20%β-TCP/PDLLA复合物,每份复合物复合rhBMP-26 mg.方法:28只新西兰兔制备L4,5横突间植骨融合模型,随机分4组:rhBMP-2/20%β-TCP/PDLLA组,20%β-TCP/PDLLA组,自体髂骨块组分别植入相应材料,空白组不植入任何材料.主要观察指标:于术后6,12周,通过大体观察、影像学、组织形态学观察,评价脊柱融合愈合情况.结果:rhBMP-2/20%β-TCP/PDLLA组及自体髂骨块组新骨形成良好,脊柱融合良好,而20%β-TCP/PDLLA组、空白组无明显的骨组织形成.结论:rhBMP-2/20%β-TCP/PDLLA复合物是一种较为理想的自体骨组织替代物,可以替代自体髂骨进行椎体间脊柱融合.
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巢式逆转录-聚合酶链反应扩增人骨形成蛋白2全长cDNA及其真核表达载体的构建
目的:利用巢式逆转录-聚合酶链反应扩增的方法,从肌肉组织中扩增人骨形成蛋白2全长cDNA并构建真核表达载体系统.方法:实验于2003-10/2005-10在苏州大学基因工程教研室和北京大学第三医院骨科实验室完成.提取成人肌肉组织内的总RNA,设计内外两对引物以巢式逆转录-聚合酶链反应扩增方法分两次扩增出人骨形成蛋白2全长1 188 bp基因,经T-A克隆装入pUCM-T质粒载体内,测序验证后,将克隆质粒以HindⅢ和XbaⅠ双酶切后与pcDNA3.0载体相连接,构建真核表达载体系统.结果:利用巢式逆转录-聚合酶链反应扩增方法能从成人肌肉组织内扩增出1 188 bp的人骨形成蛋白2全长cDNA基因,其测序结果显示与Genebank报道序列完全相符.将扩增序列双酶切后与pcDNA3.0载体相连接,经电泳验证,能构建人骨形成蛋白2全长基因的真核表达系统.结论:巢式逆转录-聚合酶链反应扩增方法能从成人肌肉组织内扩增出人骨形成蛋白2全长cDNA基因,并克隆构建真核表达载体系统,为下一步基因组织工程人工骨实验奠定基础.
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hBMP-7基因转染对原代培养兔髓核细胞生物学活性的影响
目的:探讨原代培养的兔髓核细胞转染腺病毒载体介导的人骨形态发生蛋白-7(hBMP-7)基因后对其生物学活性的影响.方法:根据兔髓核细胞转染方式的不同,分为hBMP7组、LacZ组、未转染组三组,hBMP7组采用腺病毒载体介导的hBMP7进行转染,LacZ组转染LacZ基因,未转染组不转染任何基因.比较三组细胞增殖、硫酸糖胺多糖(GAG)产量、Ⅱ型胶原产量有无差异.结果:处理方式和转染后时间对细胞增殖、GAG产量、Ⅱ型胶原产量有交互作用(P＜0.05),hBMP7组细胞增殖、GAG产量、Ⅱ型胶原产量高于LacZ组、未转染组,差异有统计学意义(P＜0.05),LacZ组和未转染组细胞增殖、GAG产量、Ⅱ型胶原产量差异无统计学意义(P＞0.05).结论:hBMP-7基因转染可提高髓核细胞增殖能力,促进其产生细胞外基质.
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人骨形态发生蛋白-7基因转染对原代培养兔髓核细胞生物学活性的影响
为探讨骨形态发生蛋白-7(BMP-7)基因疗法治疗椎间盘退变(IDD)的可行性,我们在体外将整合有人BMP-7基因的重组腺病毒载体(Ad-hBMP7)导入原代培养的兔髓核细胞内,观察BMP-7基因在髓核细胞内的表达以及对髓核细胞增殖和细胞外基质(ECM)合成的影响.
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pAAV-hBMP2-IRES质粒的构建及病毒包装
目的:构建含人骨形态发生蛋白2(hBMP2)基因的重组腺相关病毒载体.方法:根据hBMP-2基因序列设计引物,上游引入Sal Ⅰ酶切位点,下游引入EcoR Ⅰ酶切位点,以胚胎骨髓组织总RNA为模版进行rt-PCR反应扩增hBMP-2基因.将hBMP-2片段定向亚克隆进pAAV-IRES-GFP的MCS中,获得重组表达质粒(pAAV-hBMP2-IRES-GFP),采用磷酸钙沉淀法将该质粒与包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper共同转染到AAV 293细胞,进行rAAV-hBMP2-IRES-GFP重组病毒包装.收获的病毒液按氯仿处理、PEG/NaCl沉淀、氯仿反复抽提法浓缩纯化,采用荧光计数法测定重组病毒感染滴度.结果:酶切鉴定、测序结果表明,hBMP2成功克隆入pAAV-IRES-GFP载体中.在AAV 293细胞中包装出重组腺相关病毒载体的感染滴度为3.6×10<'11>/ml.结论:成功制备了rAAV-hBMP2载体,可满足骨组织工程的需要.
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骨折愈合过程中BMP-2和VEGF的临床表达意义分析
目的:分析骨折愈合过程中人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)与血管内皮细胞生长因子(VEGF)的临床表达意义.方法:选取30只实验室培养的SD大鼠为研究对象,制作骨折愈合模型,并采用免疫组织化学以及HE染色法,观察骨折不同阶段(1、7、14、21、28、35d)时,骨痂组织中BMP-2及VEGF的表达水平.结果:通过观察发现,随着骨折时间的增长,骨痂组织中BMP-2及VEGF表达呈升高趋势,且在28d时达到峰值,35d与28d相比有所下降.结论:骨折愈合阶段中,BMP-2与VEGF的表达呈升高趋势,且达到峰值后会出现回落现象,可能与骨折修复水平的提升有一定的相关性.
关键词： 骨折愈合 人骨形态发生蛋白 血管内皮细胞生长因子
