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狂犬病防制工作不容忽视
我国在公元前300多年就有狂犬病的记载，从发现狂犬病的那一天就开始了狂犬病的防治，并且随着医学生物学的发展和新技术的应用，有关狂犬病研究的各个领域也取得了可喜的成果。如狂犬病毒全基因序列的测定和分子结构的阐明，狂犬病毒致病的分子机理的日益明确和狂犬病毒基因工程口服疫苗的研究和应用。我国在狂犬病预防和研究领域也取得了可喜的成绩，如人狂犬病已从80年代的每年数千例降至目前的数百例；Vero细胞纯化狂犬病疫苗的研制成功；人腺病毒和禽痘病毒为载体表达狂犬病毒糖蛋白和/或核蛋白制备基因工程疫苗已在动物实验中证实有保护作用。与此同时我们也应看到仍有许多问题有待于继续努力和解决。 目前人狂犬病多见于亚洲的印度、泰国、斯里兰卡、柬埔寨、孟加拉国、越南和缅甸等国家,而北美和欧洲，狂犬病主要限于野生动物中。我国仍属于人狂犬病严重流行的国家之一,我国周边地区很多也是狂犬病高发病国家。从这种人、动物狂犬病的分布可以看出，人狂犬病流行的国家大都属于尚不够发达或比较落后的国家，这也揭示了一个社会整体治理的水平问题。因为狂犬病的流行很多是人为造成的，是与整个社会的文明程度和法规秩序有着直接的关系。目前在国际上，我国已逐步被列入发达国家行列，在许多领域，我们已经居世界领先地位。可是我们在狂犬病的防制方面与众多飞速发展的领域不相符合。因为一个国家的发展和先进要体现在方方面面，疾病预防与控制是其中非常重要的一个方面。狂犬病是我国《传染病防治法》中明确规定必须报告的乙类传染病之一。在过去，死亡数一直位居35种法定报告传染病之首，从80年代到90年代中期，由于国家和各级政府的重视，我国在狂犬病的控制方面卓有成效。但令人遗憾的是随着狂犬病疫情的下降，这种政府参与的多部门的联手协作没有能够继续下去，致使各部门各自为政，有些地区甚至处于无人管理状态，这种缺乏整体和全面有序的工作现状很难使狂犬病从根本上得到控制。
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不同纯化方式对脂肪细胞活性的影响
目的 研究不同纯化方式对负压抽吸获得的脂肪颗粒悬液中各组分比例及细胞活性的影响.方法 常规肿胀麻醉下,通过负压抽吸的方式获得脂肪颗粒悬液,将其分为静置组、离心组和过滤漂洗组.①静置组:根据不同的静置时间(30 s、1 min、5 min、10 min、30 min、1 h、4 h、12 h、24 h)分为9组;②离心组:采取不同的离心时间(3、5、10 min)及不同离心速度(1000、2000、3000、4000 r/min)分为12组;③过滤漂洗组:根据所采取的纱布层数(1、2和5层)分为3组.采用Calcein-AM/Hoechst33342双荧光染色法检测脂肪细胞活性,计算细胞存活率.两样本之间的组间比较采用t检验,2组样本以上的组间比较采用one-way AVOVA分析.结果 静置组的油脂、脂肪颗粒、液体层在静置5 min时趋于稳定.②离心组:当离心速度为2000 r/min、离心时间为3 min时,脂肪细胞存活率及液体比例大.③过滤漂洗组:2层纱布过滤后收集的脂肪颗粒较多.④静置5 min法、2000 r/min离心3 min法及2层纱布过滤漂洗法的细胞存活率分别为(86.75±6.29)％、(89.05±7.16)％和(87.85±5.92)％,3组比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 静置5 min法、双层纱布过滤漂洗法及2000 r/min离心3 min法脂肪细胞存活率均较高,3组比较差异无统计学意义.临床上进行少量脂肪填充时,可选择2000 r/min离心3 min法;进行大量脂肪组织填充时,过滤漂洗法则较为适用.
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用于移植的嗅鞘细胞的纯化培养方法研究
目的 探讨移植用成年大鼠嗅球嗅鞘细胞(OECs)的培养和纯化方法.方法 取成年SD大鼠嗅球,将分离消化所得细胞悬液进行接种.然后分别于接种后2 h、6 h和18 h 3个时间点进行单步骤差速贴壁法去除成纤维细胞,纯化嗅鞘细胞,纯化培养约11 d时采用神经生长因子受体P75(NGFRP75)和碘化丙啶(PI)双染OECs并对其纯度及细胞数量进行免疫荧光鉴定分析.结果 纯化培养11 d后在共聚焦显微镜下呈双染阳性的细胞为OECs,数量级达106/mL,形态以梭形、双极或三极突起为主,亦有少量多极或单极细胞.2 h、6 h和18 h组嗅鞘细胞纯度分别为(53±5)%、(73±8)%和(69±13)%,组间差异有统计学意义(F=11.766,P<0.001). 结论分别经2、6、18 h单步骤差速贴壁法纯化的OECs在纯度和数量级上均可满足移植用细胞的要求,且方法简单、经济、快捷.
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人汗腺细胞的分离和纯化培养方法探讨
目的探讨建立人皮肤汗腺细胞体外分离及纯化培养的技术.方法通过酶消化法分离人皮肤汗腺,微量加样器在倒置显微镜屏视下吸取游离的汗腺组织移入Hank平衡盐溶液(HBSS),经纯化后予以原代培养.结果分离的汗腺可在体外贴壁生长、增殖并传代,纯化处理清除了杂质细胞和组织碎片,解决了成纤维细胞对汗腺细胞培养的污染难题,且汗腺的生长能力无明显改变.结论人汗腺细胞的培养存在着分离困难和成纤维细胞污染等难题,采用本方法可以获得大量处于良好生长状态的高纯度人汗腺细胞.
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纯化取材脂肪提高实验中干细胞培养的纯度
背景:在以往脂肪干细胞原代培养的文献中大多只是剔除脂肪表面的血管组织,而对于脂肪内部的血管,尤其是血管周围淋巴结的剔除很少有文献报道.目的:探讨通过脂肪纯化来提高培养干细胞纯度的可行性.方法:将取材自同一大鼠腹股沟处的脂肪组织分成两份,一份给予纯化处理,剔除表面的血管、皮肤和肌肉组织的同时一并剔除组织内血管及其周围结节样组织.而另一份仅剔除表面血管及可能黏附的皮肤和肌肉组织,分别对两份脂肪行干细胞原代培养.结果与结论:经苏木精-伊红染色显微镜下观察,证实血管周围结节样组织为淋巴结.纯化脂肪组培养的细胞形态一致、呈长梭形.脂肪干细胞相关性抗原CD90的免疫荧光和流式细胞仪检测结果均证明纯化脂肪组培养的细胞纯度较未纯化组高.实验结果提示通过纯化取材可以提高原代培养的脂肪干细胞纯度.
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CD8+细胞免疫亲合柱的研制及条件探讨
目的:建立一种利用免疫亲合柱纯化细胞的方法.方法: 将亲合素交联于聚丙烯酰胺凝胶Bio-Gel上,制成免疫亲合柱;将外周血单个核细胞与生物素化抗CD8单克隆抗体作用后,加到该免疫亲合柱上进行纯化,CD8+细胞即吸附于柱上,洗去其他细胞后,得到纯化的CD8+细胞.结果:纯化后CD8+细胞纯度达56%～7l%,细胞回收率为39%～66%,台盼蓝染色法显示活细胞达98%. 结论:利用免疫亲合柱纯化细胞具有纯度高,回收率高,细胞活性好等优点,是一种方便有效的细胞纯化方法.
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一种原代小胶质细胞培养与纯化方法的改良
目的 建立一种简易高效的新生大鼠小胶质细胞的原代培养和纯化方法,提高小胶质细胞的产量以及纯度.方法 在传统Miriam Mecha的混合胶质细胞培养方法的基础上通过改良操作,混合培养小胶质细胞,并分别采用手拍法、摇床法以及温和胰酶消化法,纯化小胶质细胞,通过差速贴壁进一步纯化细胞.荧光显微镜下标记小胶质细胞的特异性标记物Iba1、CD11b/c进行鉴定.结果 (1)分离培养第1天小胶质细胞呈不规则圆形,折光不均匀,继续培养3~5d,小胶质细胞逐渐出现单极或多极突起,7d时部分细胞转为静止状态,呈分枝状;(2)纯化后小胶质细胞多呈静息状态,细胞免疫荧光CD11b/c、Iba1双阳性;(3)不同纯化方法细胞免疫荧光并计数显示:手拍法纯化小胶质细胞,细胞阳性率( >96%)明显高于胰酶消化法( >90%,P<0.05),前者细胞产量明显高于摇床法(P<0.05).结论 通过改良传统Miriam Mecha的混合小胶质细胞的培养和纯化方法,可以提高小胶质细胞产量以及纯度.
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嗅鞘细胞的不同纯化方法及结果
培养的嗅鞘细胞的终纯度受到多种因素的影响,如嗅鞘细胞的取材来源、分离方法等等;对培养的嗅鞘细胞进行纯化可获得高纯度的嗅鞘细胞.纯化嗅鞘细胞的方法有许多种,主要有单纯差速贴壁法、免疫吸附法、化学药物抑制法、无血清饥饿法等,现在的实验研究更趋向于以上2-3种方法联合应用对嗅鞘细胞进行纯化,这些联合纯化方案主要是在采用单纯差速贴壁方法的基础上再次运用其他一种或几种方法进行嗅鞘细胞的纯化.就获取的嗅鞘细胞的终纯度而言,许多方法取得了可观的效果.但不同的纯化方法各有利弊,除了价格不同外,不同的纯化方法对嗅鞘细胞的生物活性造成不同程度的影响.因此在选择纯化方法时,应综合考虑各方面因素,根据研究目的和实际需要选择合理的方案进行纯化.本文通过查阅各数据库中与嗅鞘细胞的分离培养及纯化有关的文献和其他相关书籍,来探讨纯化嗅鞘细胞的不同方法以及这些纯化方法对嗅鞘细胞终纯度的影响.
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CD34+细胞免疫亲合柱的研制
本文建立了利用免疫亲合柱纯化CD34+细胞的方法.将亲合素交联于聚丙烯酰胺凝胶Bio-Gel上,装于塑料柱制成免疫亲合柱;将脐血单个核细胞与生物素化抗CD34单克隆抗体作用后,加到该免疫亲合柱上进行纯化,得到纯化的CD34+细胞.纯化后CD34+细胞纯度达48.8%±18.2%,细胞回收率为55.6%±14.5%,台盼蓝染色法显示活细胞达98%.利用该方法纯化CD34+细胞具有纯度高、回收率高、细胞活性好等优点,是一种方便有效的细胞纯化方法.
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应用流式细胞分选技术高效纯化大鼠视网膜神经节细胞及其鉴定
目的 探索一种高效、稳定的纯化视网膜神经节细胞(RGC)方法.方法 结合免疫抗体吸附方法,利用流式细胞仪分离新生大鼠RGC,并采用流式细胞及荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术检测分选RGC的纯度.结果 新生SD大鼠视网膜混合细胞为(4.37 ±0.22) ×106个/视网膜,通过流式细胞仪分离出Thy1.1阳性的RGC为(5.70±0.21) ×103个/视网膜;荧光定量PCR及流式细胞分析结果均显示此方法分离的RGC细胞纯度高,可达90.11％,且纯度高低可控.结论 通过流式细胞分选技术可获得较高纯度的RGC.该方法分选速度快、稳定,为深入开展RGC的体外研究,提供了一种理想的、基于流式细胞仪的细胞快速分离纯化方法.
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流式细胞术纯化脐血嗜碱性粒细胞
目的 采用流式细胞术提纯脐血嗜碱性粒细胞,以期得到研究过敏性疾病发病机制的理想标本.方法 6份足月产妇新生儿脐血经沉淀红细胞及Ficoll-泛影葡胺处理后,采用流式细胞术分选CD203c-PE~+、CD45-PerCP~(int)的细胞.通过特异性识别嗜碱性粒细胞的阿利新蓝染色和细胞计数脐血嗜碱性粒细胞的纯度和回收率.结果 流式细胞术分选嗜碱性粒细胞所得的纯度为(95.02±2.94)V0,回收率为(61.42±5.95)%.结论 用流式细胞术分选脐血中CD203c-PE~+、CD45-PerCP~(int)的细胞可获得高纯度、高回收率的嗜碱性粒细胞.
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肿瘤细胞原代培养与保存
肿瘤细胞原代培养技术可为日益深入的肿瘤研究及治疗提供充足有效的细胞来源,是癌症在体外研究的重要手段,与体内研究相辅相成.但目前肿瘤细胞原代培养成功率不高,许多问题还需继续探讨与研究.全文综述目前国内外肿瘤原代培养方法、条件及冻存注意事项,包括:肿瘤组织类型与处理、细胞培养及纯化方法、原代肿瘤细胞生物特性检测、肿瘤细胞冻存条件等,综合探讨各方法的优缺点.比较获得更有效的肿瘤细胞原代培养方法,将其运用于探索肿瘤发生机制、肿瘤细胞治疗及药敏试验,推进肿瘤治疗的进程.
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改良冷喷注法纯化大鼠雪旺细胞的实验研究
目的 报道一种新的雪旺细胞提纯方法-改良冷喷注法,并与其他2种方法进行对比,评价其优缺点. 方法 分离新生6d的Wistar大鼠双侧坐骨神经,双酶消化法分离雪旺细胞,用S-100免疫细胞化学染色方法对雪旺细胞进行鉴定.将收集到的细胞分为3组,分别应用冷喷注法、改良冷喷注法和酶消化法对细胞进行纯化,计算纯化后的细胞纯度,流式细胞仪测定细胞活性. 结果 改良冷喷注法提纯出的雪旺细胞,纯度和细胞活性与冷喷注法比较差异无统计学意义(P＞0.05),但二者均高于酶消化组,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 改良冷喷注法提纯雪旺细胞的优点是操作简便,获得雪旺细胞纯度高且不影响细胞活性,缺点是对操作者实验操作技术和经验要求相对较高,初学者不易掌握.
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一种改进的大鼠大脑皮质星形胶质细胞的培养方法
目的:改进大鼠大脑皮质星形胶质细胞的培养方法,从而获取高纯度星形胶质细胞用于神经科学研究.方法:新生大鼠(2～3日龄),75％酒精消毒后断头,于冰上取大脑皮质置于冰冷的D-Hanks液中,去除脑膜和血管,剪碎后用0.25％胰酶消化并分离细胞,以1×105/ml的密度接种于预铺0.015％多聚赖氨酸的细胞瓶中培养.细胞纯化采用“差速贴壁法”、“梯度血清法”和“十字手摇法”,以获取高纯度星形胶质细胞.通过星形胶质细胞特异性表达蛋白即胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)行免疫细胞荧光染色来鉴定细胞纯度.结果:星形胶质细胞纯度大于98％,可多次传代,细胞增殖快,且生长良好.结论:改进的原代星形胶质细胞培养方法,操作简单,细胞纯度高,能满足各种神经科学研究中对高纯度星形胶质细胞培养的实验要求,适宜推广.
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构建糖氧剥夺模型大鼠少突胶质细胞体外培养与分离纯化
目的:对原有少突胶质细胞祖细胞培养与分离纯化方法进行改进,以简单、高效获得少突胶质细胞并建立少突胶质细胞糖氧剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)模型.方法:取SD乳鼠脑皮质,采用两种不同的细胞增殖法和两种不同的分离纯化法分四组培养,分别为细胞因子增殖联合摇床震荡分离纯化法组,B104CM增殖联合摇床震荡分离纯化法组,细胞因子增殖联合EDTA消化机械吹打分离纯化法组,B104CM增殖联合EDTA消化机械吹打分离纯化法组.倒置显微镜下观察神经细胞形态学变化并进行细胞计数.A2B5和髓鞘碱性蛋白鉴定少突胶质细胞并分析其纯度.纯化后的少突胶质细胞祖细胞分化培养3d后分四组培养,正常组正常培养,低氧组分三组,换无糖DMEM培养基,OGD 1、2、3h.然后采用MTT比色法检测细胞活力;流式细胞术分析细胞的凋亡率.结果:(1) B104CM增殖联合EDTA消化机械吹打分离纯化法较其他3种培养方法收获的少突胶质细胞祖细胞数量多(P＜0.05).(2) A2B5和MBP特异性标记,细胞纯度可达到95％.(3) MTT结果显示:OGD 1 h少突胶质细胞的细胞活力即降低(P＜0.05),随着缺氧时间延长细胞活力呈降低的趋势更加明显(P＜0.05).(4)流式细胞测细胞凋亡的结果显示:OGD 1 h、2h、3h,细胞的凋亡率分别为14.43％±0.20％,21.99％±0.42％和44.71％ ±0.20％,均高于正常对照组(6.86％±0.05％,P＜0.05).结论:(1)B104CM增殖联合EDTA消化机械吹打分离纯化培养法与其他三种方法比较实验操作简单,收获的少突胶质细胞祖细胞数量多,可用于少突胶质细胞的培养.(2) OGD可致少突胶质细胞损伤,且与OGD持续时间密切相关,实验成功的建立OGD损伤模型.
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一种改良的小胶质细胞培养方法及初步研究
为寻求一种简便、高效的小胶质细胞分离纯化技术,本实验利用"营养丧失”、振摇分离等改良的小胶质细胞培养方法,并结合原位分子杂交、免疫组化染色进行纯度鉴定.获得小胶质细胞比例占95%以上,分离纯化的小胶质细胞在LPS作用后,iNOS mRNA等表达显著.该方法简便易行,纯化程度高,为体外研究小胶质细胞的生物学特性及功能提供了条件.
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成年大鼠嗅鞘细胞的分离培养及形态学研究
目的:探讨成年大鼠嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)的分离培养和纯化方法,并观察其形态学变化及免疫组织学特性,为研究脊髓损伤后神经再牛获得丰富嗅鞘细胞来源奠定理论基础.方法:采用原代培养技术,从成年SD大鼠的嗅球分离培养嗅鞘细胞,用Nash差速贴壁法和阿糖胞苷抑制相结合的方法培养纯化,倒置相差显微镜下观察嗅鞘细胞的形态变化特点及其生长情况,并行神经生长因子受体(NGFRp75)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组织化学染色鉴定以及纯度检测.结果:体外培养的成年大鼠嗅鞘细胞主要为双极或三极细胞,其突起细长.未经纯化则成纤维细胞生长迅速而占据优势,而纯化培养后的嗅鞘细胞纯度可达90%以上.免疫细胞化学染色显示,培养的嗅鞘细胞呈现NGFRp75和GFAP染色阳性.结论:成年大鼠嗅鞘细胞的原代培养中细胞纯化是必要且必须的:而在脊髓损伤修复的研究中,Nash差速贴壁法和化学药物法不失为一种简单、经济、实用的嗅鞘细胞纯化方法.
