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用抑制性差减杂交构建As_2O_3诱导的NB4细胞凋亡相关基因文库
目的: 构建三氧化二砷(As_2O_3)诱导的急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4细胞凋亡相关基因文库.方法:用含4 μmol·L~(-1)As_2O_3和正常培养基培养NB4细胞24 h,抽提总RNA,经逆转录酶合成双链cDNA,分别以砷诱导凋亡组和对照组作为tester和driver,进行双向抑制性差减杂交(supptess-ion sublxactive hybridization,SSH),筛选As_2O_3诱导的NB4细胞凋亡相关基因,将差异表达基因进行PCR扩增并与pGEM-Teasy克隆载体连接,转化DH5 α大肠杆菌,经蓝白斑筛选获得白色阳性克隆,PCR扩增出未知基因片段.结果:成功构建了分别代表在NB4细胞中表达上调和下调的基因文库.结论: 经双向抑制性差减杂交获得了NB4细胞差异表达基因文库,为克隆NB4细胞凋亡相关基因奠定了基础.
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大鼠脑卒中相关基因的抑制性差减杂交文库构建
目的 建立寒冷加高盐刺激大鼠脑卒中的大脑组织差异cDNA文库。方法 正常Wistar大鼠随机分为寒冷加高盐刺激的实验组和不予任何处理的对照组。取实验组发生脑卒中和对照组的大脑组织。提取两组组织的mRNA，按照抑制性差减杂交试剂盒说明进行实验。在三个水平设定了检验差减效率的实验。首先是使用试剂盒提供的骨骼肌mRNA加入外源性PhiX174（HaeⅢ）作为阳性实验组与我们的实验样品进行平行差减，用来 证明系统正常。其次是采用PCR扩增看家基因GPDH的方法观察本次实验的差减效果。后在两库随机各挑取288个克隆测序，比较相同序列的重复情况。结果 差减各过程符合理论质量要求，分别得到一个脑卒中特异表达基因的片段库和一个正常特异表达基因片段库。卒中库的理论容量是7.1×104，正常库的理论容量是5.5×105。差减效率分析表明 结果良好。结论 成功地建立了一个脑卒中特异表达基因的片段库和一个正常特异表达基 因片段库。为进一步深入研究该大鼠脑卒中模型的基因奠定了基础。
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三氧化二砷改变多发性骨髓瘤细胞基因表达的研究
目的研究三氧化二砷(As2O3)对多发性骨髓瘤(MM)细胞基因表达的影响,探讨As2O3治疗MM的分子机制.方法将MM U266细胞分成对照组和实验组.取培养48 h的2组细胞提取总RNA后分离mRNA,应用抑制性差减杂交法分离差异表达基因,并连接于pGEM-T Easy Vector,转化大肠杆菌JM109,构成差减cDNA文库,经蓝白斑筛选后挑选白色菌落,提取质粒,序列测定后进行同源性比较分析.结果第1次差减分离出5个下调的基因:①氨基肽酶N;②人类肿瘤翻译控制蛋白1;③人类ATP合成酶A链;④信号识别颗粒A10;⑤线粒体ATP合成酶/ATP酶亚单位6.第2次差减分离出4个表达上调的基因:①钙结合蛋白A10;②角质素6A;③相对分子质量为45×103的含MIP重复成分的剪接因子;④多聚腺苷酸结合蛋白.结论 As2O3可能通过改变上述基因的表达,发挥其抑制MM细胞增殖、促进凋亡和诱导分化的作用.
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新基因TMBP-1的全长cDNA克隆
目的：克隆胸腺细胞发育相关新基因。方法：本研究建立了抑制性差减杂交技术(SSH)，构建了胸腺基质细胞系cDNA差减杂交文库。应用cDNA末端快速扩增方法(RACE)进一步克隆新基因的cDNA全长序列。结果：筛选两个不同胸腺基质细胞系的差异表达基因，获得了新基因cDNA片段C 91，应用RACE成功克隆新基因TMBP-1 cDNA全长序列。它拥有一个969bp的开放读码框架，编码323个氨基酸。同源序列比较发现，它编码一个未知功能的膜结合蛋白。Northem杂交分析显示，mRNA转录本长度为1．5 kb；在两种胸腺基质细胞系中均有表达。新基因的cDNA全长序列，已被GenBank所接受。结论：抑制性差减杂交技术是克隆新基因片的有效方法；成功克隆新基因TMBP-1的cDNA全长序列。
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淡色库蚊对溴氰菊酯抗药性和敏感性相关基因克隆和序列分析
目的获取淡色库蚊对溴氰菊酯抗药性和敏感性相关基因. 方法通过正、反向抑制性差减杂交获取对溴氰菊酯抗药性和敏感性淡色库蚊的差异表达基因,并以基因芯片和逆Northern对所获基因进行杂交鉴定. 结果正、反向抑制性差减杂交各获得523和286个克隆,经芯片鉴定后在抗性品系高表达的基因分别有 155个(2～3倍)和42个(3倍以上),在敏感品系中高表达的基因分别有15个(2～3倍)和9个(3倍以上).对3 倍以上差异表达和特异表达基因进行单向测序,根据高同源性比对结果,线粒体rRNA基因、60S核糖体蛋白基因、40S核糖体蛋白S4基因、胰蛋白酶前体基因、糜蛋白酶A前体基因、视蛋白基因等在抗性品系中高表达;而40S核糖体蛋白S29基因和肌球蛋白调控轻链2在敏感品系中高表达;另外,1,4-α-葡聚糖分支酶和核糖体蛋白46基因在抗性品系中特异表达. 结论所获得的13个差异表达基因和2个特异表达基因与淡色库蚊对溴氰菊酯的抗药性和敏感性相关.
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两个标准化cDNA差减文库的构建
目的构建2个标准化cDNA差减文库.方法以淡色库蚊对溴氰菊酯抗药性品系为Tester、敏感性品系为Driver,进行正向抑制性差减杂交;以敏感品系为Tester、抗性品系为Driver,进行反向抑制性差减杂交.分别将获取的2组抑制性差减杂交产物克隆入质粒表达载体(PinPointTM Xa-1T-Vector),并以PCR扩增鉴定插入片段.结果获得2个标准化cDNA差减文库,其中抗性相关基因(抗性品系高表达或特异表达)文库含523个重组子,敏感相关基因(敏感品系高表达或特异表达)文库含286个重组子.插入片段大小平均约360 bp.结论所建的2个差减文库适合做进一步研究.
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高脂血症敏感兔肝组织差减cDNA文库的构建
目的:构建高脂血症敏感兔肝组织差异表达基因的抑制差减cDNA文库.方法:分别从兔高脂血症敏感组和非敏感组肝组织分离mRNA,合成双链cDNA,酶切后将敏感组cDNA分成两组,分别与不同的接头连接,再通过两轮差减杂交和两次抑制性PCR得到两者之间差异表达的cDNA.将PCR产物与T/A载体连接构建差减cDNA文库.挑取克隆进行PCR扩增鉴定.结果:构建的差减cDNA文库包含500个克隆,其中463个有插入片段,大小范围在250～700 bp之间.结论:用抑制性差减杂交及T/A克隆技术成功构建了高脂血症敏感兔差异表达基因差减cDNA文库.
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用抑制性差减杂交法和基因芯片鉴定蚊虫抗药性和敏感性相关基因
由于杀虫剂的广泛、大量和长期使用,媒介昆虫对杀虫剂逐步产生了抗药性(抗性).对媒介昆虫抗性的分子机理研究具有重要的理论意义和潜在的应用价值.抗药性和(或)敏感性相关基因的分离将为抗性分子机理的深入研究打下基础.近年来,国外研究者采用经典的"功能克隆法"克隆到一些抗药性相关基因.然而,在事先无目的蛋白或其相应基因定位的情况下分离这些基因是相当困难的.近建立的抑制性差减杂交法(suppression subtractive hybridization, SSH)这一"表型克隆"新策略,无需事先知道起作用基因的背景资料,仅凭表型直接分离基因,为抗性基因的分离提供了有效手段.本研究将SSH与具有高通量鉴定能力的基因芯片(gene chip)技术结合,极大地提高了相关基因的分离速度和效率,部分结果并经逆Northern(reverse northern)进行了进一步验证.
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双链RNA病毒诱导的牙鲆胚胎细胞差减cDNA文库的构建
以紫外线灭活的dsRNA病毒草鱼出血病病毒(GCHV)诱导和模拟诱导的牙鲆胚胎细胞为材料,利用抑制性差减杂交(SSH)技术,成功构建了双链RNA病毒诱导的牙鲆胚胎细胞(FEC)差减cDNA文库.以管家基因α-tublin作为差减指标,经检测,该文库差减效率达2 10倍,表明经病毒诱导后某些差异表达基因也得到了相应倍数的富集.将获得的cDNA片段连接到pGEM-T载体,PCR检测显示差减片段在250bp～2 000bp之间.该差减cDNA文库的构建为从分子水平研究牙鲆培养细胞对dsRNA病毒的免疫反应、以及进一步鉴定和克隆差异表达基因打下了坚实基础.
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慢性间歇缺氧兔模型肝组织cDNA文库构建
目的:构建抑制性差减cDNA文库筛选鉴定慢性间歇性缺氧兔模型肝脏相关基因.方法:选取24只兔随机分成4组,分别为普通饲料喂饲组,高脂饲料喂饲组,间歇性缺氧组和高脂并间歇性缺氧组.提取高脂组和高脂并间歇性缺氧组兔肝脏组织mRNA,酶切cDNA,分别与不同的接头连接,经过两轮差减杂交和两次抑制性PCR后得到两者之间差异表达的cDNA.将PCR产物与T/A载体连接构建差减cDNA文库.挑选克隆进行PCR扩增鉴定.结果:基于高脂组和高脂并间歇性缺氧组兔腹主动脉和肝病理改变的基础,构建的差减cDNA文库包含500个克隆,其中462个有插入片段,大小为250～700 bp.鉴定获得1个新基因Cthrc1,GenBank登录号XM_418373.结论:对Cthrc1基因的研究有助于进一步阐明慢性间歇性缺氧促进动脉粥样硬化形成的分子机制.
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骨质疏松症骨组织cDNA差减文库的构建
目的 构建人抑制差减文库,为筛选骨质疏松骨相关基因奠定基础.方法 分别从正常骨和骨质疏松症骨组织分离mRNA并反转录成cDNA,酶切后骨质疏松cDNA分成两组,分别与不同的接头连接.经过两轮差减杂交和两次抑制性PCR后得到两者之间差异表达的cDNA挑取克隆进行PCR扩增鉴定.结果 成功地构建了骨质疏松相关的的差减cDNA文库,获得的正、反向差减文库分别含652、345个重组子;插入片段的平均大小为526 bp.结论 该差减cDNA文库的建立为进一步在分子水平上阐明骨质疏松症的分子机制奠定了基础.
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聚合酶链反应为基础的差异表达基因分析技术及其在肾脏疾病研究中的应用
随着人类基因组计划的完成,探讨基因的功能及其在人类疾病中的作用是未来基因研究工作的重点.其中,基因表达的差异分析对阐明各种疾病的分子基础具有重要意义.自90年代以来,以聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)为基础的差异表达基因分析技术,即:差异显示逆转录PCR(differential display reverse transcription-PCR,DDRT-PCR)、cDNA代表性差异分析(representational diffcrence analysis of cDNA,cDNA-RDA)和抑制性差减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)等在肾脏疾病研究领域中被广泛应用并已经成功地分离和克隆了一些与肾脏疾病相关的基因.结合自己的研究工作,我们主要介绍这3种技术的基本原理、主要操作方法、各自的优、缺点以及它们在肾脏疾病研究中的应用.
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应用抑制性差减杂交技术构建铁皮石斛差减cDNA文库的探讨
[目的]探讨构建铁皮石斛抑制差减文库的方法,为克隆石斛碱生物合成相关功能基因奠定基础.[方法]采用抑制性差减杂交(SSH)技术,分别以4年生和1年生铁皮石斛叶片互补脱氧核糖核酸(cDNA)作为检测子(tester)与驱赶子(driver),将所获得差减cDNA片段克隆入质粒表达载体(PointTMXa-1 T-Vector),转化大肠杆菌JM109,聚合酶链反应(PCR)扩增鉴定插入片段.[结果]成功地构建了与石斛碱生物合成相关的差减cDNA文库,获得的正、反向差减文库分别含560、220个重组子;插入片段的平均大小为550bp.[结论]所构建的差减cDNA文库适合进一步克隆分析石斛碱相关功能基因研究.
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骨质疏松骨组织差异表达基因消减cDNA文库的构建
目的构建抑制差减文库,为克隆、筛选骨质疏松骨组织中失活或低表达的致骨质疏松相关基因奠定基础.方法分别从小鼠正常骨和骨质疏松骨组织分离mRNA,合成双链cDNA,酶切后骨质疏松cDNA分成两组,分别与不同的接头连接.应用抑制性削减杂交(SSH)技术,分别以正常骨组织与骨质疏松小鼠cDNA作为检测子(tester)与驱赶子(driver),在通过两轮差减杂交和两次抑制性PCR得到两者之间的差异表达的cDNA,将所获得差减cDNA片段克隆入质粒表达载体(PointTM Xa-1 T-Vector),转化大肠杆菌JM109,挑取克隆进行PCR扩增鉴定插入片段.结果成功地构建了骨质疏松相关的的差减cDNA文库,获得的正、反向差减文库分别含576、322个重组子;插入片段的平均大小为5 30bp.结论该差减cDNA文库的建立为进一步筛选、鉴定骨质疏松发生过程中的相关调控基因奠定了基础.
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抑制性差减杂交技术分离白血病多药耐药基因
目的：分离及鉴定与白血病多药耐药性相关的差异表达基因。方法采用抑制性差减杂交（SSH）技术分离非耐药细胞株 K562与耐药细胞株 K562／DOX 差异表达基因。提取总 RNA ，逆转录合成 cDNA ，经限制性内切酶 Rsa Ⅰ酶切后，分别与不同的接头（adopter1和 adopter2R）连接；连接产物插入 pMD19-T 载体后转入大肠埃希菌中，构建 cDNA 差减文库；挑取阳性克隆提取质粒进行测序及同源序列分析，确定差异表达基因。结果筛选获得220个差异表达基因，包括血红蛋白、核糖体和线粒体等相关基因，以及热休克因子结合蛋白（HSPB1）基因等其他基因。结论采用 SSH 技术及分子克隆技术可构建耐药及非耐药肿瘤细胞株差异表达基因的差减 cDNA 文库，能够为进一步筛选、克隆肿瘤细胞多药耐药性相关差异表达基因奠定基础。
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幼年新西兰白兔损伤关节软骨再生相关基因的鉴定与分析
目的 克隆幼年新西兰白兔膝关节软骨损伤后主导修复的相关基因,探讨关节软骨损伤后修复机制.方法 应用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)获得差异表达基因片断,通过PCR筛选、杂交验证、同源性检索对差异表达基因进行分析.结果 成功地克隆了17个差异表达基因片断,鉴定了11个,发现6个新基因片断,在GeneBank登录并获得注册.结论 所得到的差异表达基因与关节软骨细胞关系密切,为进一步研究关节软骨损伤后修复机制奠定了基础.
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线粒体基因表达改变在大鼠脑卒中发生中的作用
目的探讨线粒体基因表达改变在大鼠脑卒中发生中的作用.方法应用冷刺激加高盐饮食复合环境因素作用于Wistar大鼠,诱发大鼠高血压脑卒中,应用抑制性差减杂交技术对卒中样发作鼠和正常对照鼠脑的差异基因进行筛选.经过两轮杂交后,产生的克隆均为脑卒中鼠脑组织特异表达的序列.每组随机挑取288个克隆,进行测序及GenBank Blast生物信息分析.结果两组共有456个可用序列,我们对每个与已知基因高度同源的序列以功能为参照进行了分类,发现大鼠脑卒中后脑组织线粒体基因转录出现的频数高达26.5%,60个克隆与线粒体基因高度同源(P＜0.01),线粒体基因表达明显上调.结论线粒体基因表达发生改变,可能造成脑卒中的敏感性增加.
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应激引起大鼠脑卒中时脑组织细胞与机体防御基因的表达差异
目的:探讨应激引起大鼠脑卒中时细胞与机体防御基因的表达差异以及在发病学中的意义.方法:应用冷刺激加高盐饮食复合刺激因素作用于Wistar大鼠,诱发大鼠高血压脑卒中作为模型,应用抑制性差减克隆技术对卒中样发作鼠和正常对照鼠脑的差异基因进行筛选.经过两轮杂交后,产生的克隆均为脑卒中鼠脑组织特异表达的序列.每组随机挑取288个克隆,进行测序及GenBankBlast生物信息分析.结果:两组共有456个可用序列,经对每个与已知基因高度同源的序列以功能为参照进行分类,发现大鼠卒中后脑组织细胞与机体防御基因表达明显下调(P＜0.01),卒中组的288个克隆中未发现运输蛋白/膜转运及应激反应相关基因的表达.结论:脑组织运输蛋白/膜转运及应激反应相关基因的表达发生改变,可能是脑卒中发生的分子机制之一.
