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尿多酸肽通过调节caspase家族诱导多发性骨髓瘤细胞U266凋亡的实验研究
目的 探讨尿多酸肽抑制多发性骨髓瘤(MM)细胞株U266增值及其机制.方法 采用四甲基偶氮唑(MTT)比色法计算不同尿多酸肽浓度(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/g)对U266细胞生长的抑制率,Hoechst33258染色观察尿多酸肽作用后的细胞凋亡情况,Annexin-V/碘化丙啶(PI)检测尿多酸肽作用6、12、24 h后与对照组细胞(加细胞未加药物)的细胞凋亡率.使用Western-blotting法检测caspase 8、caspase 3及其激活物在U266细胞株经尿多酸肽(4 mg/g)作用6、12、24 h后的表达改变.结果 随着尿多酸肽浓度提高,U266细胞抑制率显著上升(F=17.276,P<0.001).经尿多酸肽作用后,Hoechst33258荧光染色提示细胞核浓集及出现凋亡小体.Annexin-V/PI分析显示,尿多酸肽处理6、12、24 h后细胞凋亡率显著高于对照组细胞[(5.53±0.28)％、(9.43±1.78)％、(21.50±2.45)％、(3.03±0.11)％,F=12.242,P<0.001].同时,随着尿多酸肽作用时间延长,pro-caspase 8、pro-caspase 3表达明显下降(F=18.241,P<0.001;F=4.924,P=0.005),而active-caspase 8、active-caspase 3表达明显上升(F=22.322,P<0.001;F=6.213,P=0.002).结论 尿多酸肽可抑制U266细胞增殖,且可能通过caspase凋亡途径在其中起主要作用.
关键词： 尿多酸肽 U266 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 多发性骨髓瘤 细胞凋亡 -
组蛋白去乙酰化酶抑制剂MS-275对U266细胞增殖的影响
目的 研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂MS-275对人多发性骨髓瘤细胞U266增殖的影响.方法 将不同浓度的MS-275以不同时间作用于U266细胞,用台盼蓝拒染法观察药物对细胞活力的影响;瑞氏-姬姆萨染色观察药物对细胞形态学变化;流式细胞仪分析细胞周期;Western Blot检测P21、Cdk4、Acetyl-histone H3及PARP等的蛋白表达.结果 MS-275呈时间和剂量依赖性抑制U266细胞增殖,阻断细胞周期于G0/G1期,细胞发生明显变化.出现P21表达增加,Cdk4表达下降,同时出现PARP的裂解.结论 组蛋白去乙酰化酶抑制剂MS-275具有抑制人骨髓瘤细胞U266增殖作用,使细胞阻滞在G0/G1期,终诱导U266细胞凋亡.
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三氧化二砷改变多发性骨髓瘤细胞基因表达的研究
目的研究三氧化二砷(As2O3)对多发性骨髓瘤(MM)细胞基因表达的影响,探讨As2O3治疗MM的分子机制.方法将MM U266细胞分成对照组和实验组.取培养48 h的2组细胞提取总RNA后分离mRNA,应用抑制性差减杂交法分离差异表达基因,并连接于pGEM-T Easy Vector,转化大肠杆菌JM109,构成差减cDNA文库,经蓝白斑筛选后挑选白色菌落,提取质粒,序列测定后进行同源性比较分析.结果第1次差减分离出5个下调的基因:①氨基肽酶N;②人类肿瘤翻译控制蛋白1;③人类ATP合成酶A链;④信号识别颗粒A10;⑤线粒体ATP合成酶/ATP酶亚单位6.第2次差减分离出4个表达上调的基因:①钙结合蛋白A10;②角质素6A;③相对分子质量为45×103的含MIP重复成分的剪接因子;④多聚腺苷酸结合蛋白.结论 As2O3可能通过改变上述基因的表达,发挥其抑制MM细胞增殖、促进凋亡和诱导分化的作用.
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骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞可异常影响骨髓瘤细胞株的趋化功能
背景：多发性骨髓瘤患者骨髓微环境中间充质干细胞有多种异常，但异常的间充质干细胞对骨髓瘤细胞的趋化功能影响目前仍不清楚。
目的：比较正常人与多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞在体外对骨髓瘤细胞株趋化迁移的影响。
方法：体外培养的正常人骨髓间充质干细胞或初诊骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞，在有或无硼替佐米条件下，分别与骨髓瘤细胞株U266细胞直接共培养，比较U266细胞的Transwel 迁移率、定量PCR检测mRNA的表达水平。同时还检测 U266细胞对正常人骨髓间充质干细胞或骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞培养液上清的Transwel 迁移情况。
结果与结论：正常人骨髓间充质干细胞或骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞与 U266细胞直接共培养后，两组骨髓瘤细胞的趋化特性有区别，表现为骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞组的U266细胞基础Transwel 迁移率高、CCR1的表达水平高(P均<0.05)。硼替佐米处理U266细胞后并不能消除两组的的区别。然而，U266细胞对正常人骨髓间充质干细胞或骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞培养液上清的Transwel 迁移并没有明显区别。结果提示骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞本身存在一些内在缺陷，在与骨髓瘤细胞株 U266相互作用过程中，可以影响 U266的体外趋化功能，并且这一影响主要是通过骨髓间充质干细胞与骨髓瘤细胞直接相互作用引起的。 -
蛋白酶体抑制剂PS-341对U266细胞凋亡和多种细胞因子表达影响的研究
目的:探讨蛋白酶体抑制剂PS-341(bortezomib)诱导多发性骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡时对IL-6、IL-1β和SCF细胞因子表达的影响.方法:用含15%FBS的RPMI1640培养液体外培养U266细胞,分别用0、50、100、150、200 nmol/L的PS-341干预U266细胞4 h后收集,荧光显微镜观察细胞凋亡,Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率的变化,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析U266细胞IL-6、IL-1β和SCF三种细胞因子表达的改变.结果:荧光显微镜和FCM发现PS-341以浓度依赖方式诱导U266细胞凋亡;PS-341明显抑制U266细胞IL-6、IL-1β和SCF的表达(P＜0.05);对IL-6和SCF的抑制与PS-341浓度成正相关,对IL-1β的抑制在PS-341浓度为0～150 nmol/L时成正比关系,当浓度大于150 nmol/L时差异无显著性.结论:蛋白酶体抑制剂PS-341诱导U266细胞凋亡时明显抑制其IL-6、IL-1β和SCF的表达,是有效治疗MM的机制之一.
关键词： 蛋白酶体抑制剂PS-341 凋亡 细胞因子 U266 -
异硫氰酸苯已酯诱导骨髓瘤U266细胞P16基因去甲基化
目的 研究异硫氰酸苯己酯(PHI)对骨髓瘤U266细胞株P16基因的去甲基化作用并探讨其作用机制.方法 应用半定量逆转录-聚合酶链反应检测U266 细胞经过PHI 处理后DNA 甲基转移酶DNMT1、DNMT3a 和DNMT3b基因的mRNA 的表达变化,用甲基化特异性聚合酶链反应检测PHI 作用前后U266细胞株P16 基因甲基化状态的变化.结果 使用不同浓度的PHI处理U266细胞72 h后,U266细胞表达DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA的水平明显降低并呈浓度依赖性.以不同浓度的PHI处理U266细胞10d后,P16基因的甲基化状态被逐渐逆转.结论 PHI 可能通过抑制DNA 甲基转移酶的表达水平诱导P16 基因产生去甲基化,使失活的抑癌基因重新激活,诱导瘤细胞凋亡.
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蛋白酶体抑制剂PS-341诱导U266细胞凋亡与胞浆内[Ca2+]变化的关系
目的 探讨蛋白酶体抑制剂PS-341(Bortezomib)诱导骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡时对其胞浆内[Ca2+]([Ca2+]i)的影响.方法 以浓度梯度的PS-341干预U266细胞4h后收集,荧光显微镜观察细胞凋亡,Annexin V-FITC/PI双参数流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡,Fluo-3/AM荧光素标记FCM检测[Ca2+]i.结果 (1)PS-341作用U266细胞4h后荧光显微镜观察到凋亡细胞数随浓度增加而增多;(2)FCM检测凋亡细胞的比例分别为0.56%、7.71%、19.84%、31.10%、40.72%,与PS-341浓度成正比;(3)PS-341作用后U266细胞[Ca2+]i均值分别为403.65 nmol/L、418.20 nmol/L、378.65 nmol/L、356.36 nmol/L、349.21 nmol/L;(4)PS-341诱导U266细胞凋亡时伴随[Ca2+]i的改变,浓度＞50 nmol/L时诱导的细胞凋亡伴随[Ca2+]i下降.结论 蛋白酶体抑制剂PS-341诱导骨髓瘤细胞凋亡呈浓度依赖性;PS-341浓度＞50 nmol/L时下调[Ca2+]i,并由此发挥抗骨髓瘤细胞作用.
关键词： 蛋白酶体抑至PS-341 胞浆内[Ca2+] 细胞凋亡 U266 -
4种丹参酮类化合物对U266细胞增殖的抑制作用及机制
目的 研究丹参酮ⅡA(TAⅡA)、丹参酮Ⅰ(TAⅠ)、隐丹参酮(CTA)及二氢丹参酮Ⅰ(DIA Ⅰ)对U266细胞的增殖抑制作用及其可能的机制.方法 采用CCK法检测4种丹参酮类化合物对U266细胞的增殖抑制率,用Annexin-V-FITC/PI检测细胞的凋亡,用PI法检测细胞周期;收集多发性骨髓瘤患者的骨髓标本,分离培养间充质干细胞(MSCs),用流式细胞仪检测4种丹参酮类化合物对MSCs分泌白介素6(IL-6)的影响.结果 4种丹参酮类化合物对U266细胞的增殖均有抑制作用;DIA Ⅰ较其余3种化合物的作用更强,引起细胞早期凋亡较多,细胞周期被阻滞在S期;DIAⅠ能明显抑制IL-6的分泌,其余3种化合物对IL-6的分泌作用无统计学意义.结论 DIA Ⅰ能明显抑制多发性骨髓细胞株U266的增殖,其抑制作用可能是通过抑制MSCs分泌IL-6而实现的.
