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庚肝病毒全长基因组构建成功
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一种高效扩增血清松弛环状乙型肝炎病毒DNA全长基因组方法的研究
目的：建立基于滚环复制的、高效扩增血清松弛环状乙型肝炎病毒DNA（HBV RC-DNA）全长基因组的方法。方法以60例慢性乙型肝炎患者血清HBV RC-DNA为研究对象，利用T4 DNA polymerase和T4 DNA ligase，封闭HBV RC-DNA基因组上的缺口，使之成为闭合环状结构；再通过Phi29 DNA polymerase的作用，对闭合环状的HBV基因组进行滚环复制，以滚环复制后的RC-DNA为模板扩增HBV全长基因组。结果成功建立了基于滚环复制的HBV RC-DNA全长基因组扩增方法，可从病毒载量为108~104拷贝/ml样本中扩增出HBV全长基因组。对于107~105拷贝/ml血清样本来说，使用基于RC-DNA滚环复制的全长基因组扩增方法，与以往的一步法扩增相比，扩增效率显著提高。结论基于滚环复制的HBV RC-DNA全长基因组扩增方法具有较高的灵敏度。该方法的建立为H BV全基因组研究提供了一种新的、有效的工具，有望在基础和临床研究中广泛应用。
关键词： 松弛环状乙型肝炎病毒DNA 全长基因组 扩增 滚环复制 -
卡波济肉瘤相关疱疹病毒感染与肿瘤的发生
一、卡波济肉瘤相关疱疹病毒卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)系于1994年由卡波济肉瘤(KS)以PCR为基础的差别克隆技术(代表性差异分析,RDA)分离出的部分基因组.因该片段与EBV衣壳基因具有一些同源性,考虑其相关病毒为一种γ疱疹病毒,后经成功克隆其全长基因组而获确认.实际上,该病毒属与EBV所属γ1疱疹病毒(lymphocrytovirus)仅有一线之隔的γ2疱疹病毒(Rhadinovirus)亚科.γ疱疹病毒与α疱疹病毒一样,也广泛分布于哺乳类,现已分离出多种,EBV即为其一.这些病毒与B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤或纤维肉瘤等肿瘤密切相关,其主要者列于表1.此一事实即为γ疱疹病毒可列举为DNA肿瘤病毒之一的1个理由.可以说KSHV同KS和原发性渗出性淋巴瘤(primary effusim lymphoma,PEL)的相关性几乎达100%,其与肿瘤发病如此密切相关者尚且无二.
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丙型肝炎病原学研究进展
自1989年Choo等成功地克隆HCV DNA以来,丙型肝炎病原学研究取得显著进展.近几年对HCV基因组的结构和功能、翻译产物、变异和分型研究较为深入.国内也成功地克隆了流行的HCV河北株全基因序列,北京和上海等地也相继分离得到HCV全长基因组.
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乙肝病毒共价闭合环状DNA标准品制备及鉴定
目的 通过构建乙肝病毒(HBV)重组质粒来制备共价闭合环状DNA(cccDNA),为cccDNA定量检测提供合适的标准品.方法 选择本院就诊的2名慢性乙肝患者,采取蛋白酶K消化法提取其血清病毒DNA,运用高保真聚合酶扩增HBV DNA,然后将扩增片段插入克隆载体构建HBV重组质粒.以重组质粒为模板制备环状DNA,经测序鉴定和PCR定量检测.结果 HBV DNA全长序列被成功扩增,并顺利构建重组质粒.2个重组质粒经内切酶消化均能得到预期的HBV DNA片段(约3.2 kb)和载体DNA片段(约2.7 kb);经测序鉴定,2个质粒分别为HBV B和C基因型,其插入序列保真性好,错配率低,每kb分别为1.24 bp和1.56 bp;以重组质粒为模板制备的2个环状DNA长度均约为2.1 kb,测序证实为HBV cccDNA;经定量检测,其纯度高,浓度分别为1.05×1010 IU/ml和6.19 × 109 IU/ml.结论 利用重组质粒方式制备的HBV cccDNA具有纯度高、获取量大等优点,可作为cccDNA定量检测和方法性能验证的标准品.
