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160六价铬诱导P53蛋白活化的机制
本研究探讨了Cr(Ⅵ)诱导P53活化的机制.培养人肺上皮细胞系A549并进行传代.取3×105A549细胞转入一个6孔平皿,于37℃下温孵24h,立即转染1μg报告质粒和1μg β-半乳糖苷酶(β-Gal)质粒,温孵过夜后冲洗,加入含10%FBS的F-12K培养基,再培养24h后加入5、10、20、50和100μmol/L的Cr(Ⅵ)溶液处理(未经处理的为对照),然后加入400μl报道溶解缓冲液,在4℃下抽提细胞2h;取80μl细胞溶解产物测量虫荧光素酶和β-Gal活性,结果以β-Gal标化的相对P53活性(与对照相比)来表示.另取经Cr处理后的A549细胞,抽提细胞经声处理断裂DNA和减少粘度,然后取20μl全细胞溶解产物加热、离心,进行蛋白印迹分析(Westernblot).取细胞溶解产物、20μlRecin/TNT(1:10)和10μg抗体在4℃下温孵过夜并离心,取上清进行Western blot反应.
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感光受体外周蛋白结合蛋白对虫荧光素酶体外折叠的促进作用
探讨感光受体外周蛋白结合蛋白(PBP)在体外是否有促进变性蛋白质复性的作用.虫荧光素酶用盐酸胍变性,然后在PBP、HSP70、HSP60存在下进行体外复性,用虫荧光素酶分析系统检测该酶的复性程度.结果显示PBP对虫荧光素酶的复性能力很低,当与HSP70同时作用时,酶活力明显高于PBP或HSP70组,而PBP与HSP60组合对酶的复性能力较HSP60组未见有明显差异;当PBP,HSP70,HSP60三者同时存在时,酶活力恢复率高.去除复性缓冲液中的ATP及其再生系统,酶活力的复性率明显下降.结果表明PBP具有协助HSP70,在ATP依赖的情况下促进变性虫荧光素酶体外复性的分子伴侣功能.
关键词： 感光受体外周蛋白结合蛋白 热休克蛋白 虫荧光素酶 复性 -
转虫荧光素酶基因细胞在亲电性化学污染物监测中的应用研究
目的 用亲电性反应元件(EPRE)调控的转虫荧光素酶基因细胞快速评价环境的污染程度.方法 采用分子生物学的方法,将EPRE与TK基本启动子和编码虫荧光素酶(LUC)的基因相融合,构建成EPRE调控的LUC稳定表达载体,将其转染于HeLa细胞,经G418筛选出稳定的细胞株.该细胞经不同浓度的亚砷酸钠(NaAsO2)、氯化镉(CdCl2)、氯化汞(HgCl2)和顺丁烯乙酸二乙酯(DEM)作用后,用荧光素酶试剂盒物测LUC的表达量.结果 DNA测序显示,EPRE调控的LUC稳定表达载体结构框架正确;LUC的表达量与受试物具有一定的剂量-效应关系,其中DEM的剂量-效应关系明显.结论 EPRE调控的转LUC基因细胞构建成功.
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HSV-1作用于KSHV ORF50启动子区中特异性应答位点序列的初寻
目的:构建卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)ORF50启动子系列截短序列克隆,初步寻找HSV-1作用于KSHV ORF50启动子区中特异性应答位点序列.方法:以KSHV基因组为模板,PCR扩增KSHVORF50启动子系列截短序列,克隆至含有虫荧光素酶(Luciferase)报告基因的基本载体pGL-3中,构建含ORF50启动子系列截短序列的重组Lueiferase报告质粒.系列重组报告质粒经酶切鉴定和序列测定分析后,分别转染单纯疱疹病毒1型(HSV-1)感染后的非洲绿猴肾细胞(Vero细胞),进行Luciferase活性检测,计算并比较相对Lueiferase活性单位(Relative lueiferase activity unit,RLU).结果:成功分离、克隆KSHV ORF50启动子系列截短序列;HSV-1感染随后转染重组质粒p50-95,p50-46和p50-17与转染p50-1500、p50-750、p50-375及p50-185相比,Vero细胞中Lueiferase活性显著下降.结论:成功构建了含KSHV ORF50启动子系列截短序列的重组Lueiferase报告质粒;HSV-1所对应的、能够主导ORF50启动子活性的小顺式调控区位于-185 bp和-95 bp之间.
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超声介导SonoVue微泡破裂促进报告基因在肝脏中表达的实验研究
目的:探讨超声介导SonoVue微泡破裂法促进外源基因在肝脏中表达的作用,评估其转染效率、安全性.方法:经SD大鼠门静脉置管输入SonoVue微泡建立动物模型,以虫荧光素酶基因为报告基因,观察不同浓度的微泡促进虫荧光素酶基因在肝脏中的表达强度与持续时间,实验结束后采下腔静脉血检测肝肾功能并取肝、肾组织常规HE染色行组织学检查.结果:随着微泡浓度的增加,虫荧光素酶基因表达逐渐增加,在微泡浓度为100%(V/V)时,转染效率高,持续到21天仍有表达.转染前后的肝肾功能(AST、ALT、ALB、BUN、Cr)无明显变化,HE切片未发现肝肾组织结构的改变.结论:超声介导微泡破裂法能有效地促进外源基因在肝脏中的表达,为肝脏疾病的基因治疗提供了新的途径.
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人Tudor-SN基因启动子荧光素酶报告基因表达质粒的构建及活性检测
目的 将人类Tudor-SN基因的启动子序列片段定向连入pGL3-Basic质粒载体,并进行鉴定和启动子活性检测.方法 以HeLa细胞全基因组DNA为模板,PCR法扩增出目的基因,利用XhoⅠ和HindⅢ双酶切法将目的片段连接到pGL3-Basic载体上.再将构建成功的pGL3-Basic-Tudor-SN-promoter重组质粒和内参质粒β-gal瞬时共转染入宫颈癌HeLa细胞,培养48 h后检测萤火虫荧光素酶活性.结果 双酶切和基因测序法鉴定构建的重组质粒无误,转染重组质粒后可检测到萤火虫荧光素酶活性.结论 成功构建了人类Tudor-SN基因启动子重组质粒,为Tudor-SN蛋白基因调控机制的研究奠定基础.
关键词： 人类Tudor-SN蛋白 启动子 重组质粒 虫荧光素酶 -
aP2增强子和启动子荧光素酶基因载体的构建及鉴定
目的 构建aP2基因增强子和启动子驱动虫荧光素酶表达的真核表达载体,为进一步研究aP2基因表达调控机制及其信号转导通路等莫定基础.方法 提取小鼠肝脏基因组DNA,PCR扩增aP2增强子和启动子,并将其与虫荧光素酶报告质粒PGL3-Basic连接,通过测序鉴定.结果 小鼠aP2基因的增强子和启动子正确插入虫荧光素酶真核表达载体,测序结果与GENEBANK报道序列一致.结论 aP2基因增强子和启动子驱动虫荧光素酶表达的真核表达载体构建成功.
