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云南省西部边境新分离蚊媒病毒分子生物学特征分析
目的 分析云南中缅边境地区新分离蚊媒病毒的分子生物学特征,以分析其遗传进化特征.方法 2010年1-12月在云南省德宏州芒市和瑞丽市监测点每月一次用诱蚊器采集蚊虫,用BHK-21和C6/36细胞分离病毒,阳性分离物用RT-PCR法进行鉴定及序列测定和分析.结果 从采获的7属42种69 209只蚊虫中分离到13株流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV),4株盖塔病毒(Getah virus,GETV),1株西藏环状病毒(Tibet orbivirus,TIBOV),7株淡色库蚊浓核病毒(Culex pipiens pallens densovirus,CppDNV).JEV E基因进化分析证实,新分离的13株JEV均属基因Ⅰ型,与云南其它地区和邻近省份流行株亲缘关系较近,且抗原和毒力位点未发生明显改变.4株GETVE2基因与云南其它地区分离株同源性高,亲缘关系近.新分离环状病毒的VP1基因与TIBOV亲缘关系近,而与云南环状病毒(Yunnan orbivirus)存在明显差异.7株CppDNV的NS1基因与以往云南及其他省区流行株具有较高的同源性和亲缘关系.结论 首次证实该地区存在基因Ⅰ型JEV、GETV、TIBOV和CppDNV流行,这些流行株均具有较为稳定的遗传特征和地域特征.
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云南省德宏州2007年和2010年蚊虫及蚊媒病毒调查
目的：调查云南省德宏州蚊虫和蚊媒病毒分布特点。方法2007年和2010年的7月在德宏州5个县市利用诱蚊灯采集蚊虫标本，采用C6/36和BHK-21细胞分离病毒，RT-PCR和序列分析方法鉴定病毒分离物。结果共采集到6属29种43634只蚊虫，其中三带喙库蚊构成比高达78.69%，中华按蚊构成比为14.77%，其他蚊种数量较少。从蚊虫中分离到6株病毒，经RT-PCR和进化分析表明，其中3株为基因Ⅰ型流行性乙型脑炎病毒（JEV），均分离自三带喙库蚊；1株盖塔病毒（GETV）分离自三带喙库蚊；2株淡色库蚊浓核病毒（CppDNV）分别分离自三带喙库蚊和迷糊按蚊。结论三带喙库蚊是德宏州优势蚊种和蚊媒病毒主要传播媒介，当地存在基因Ⅰ型JEV、GETV和CppDNV的流行，并与以往云南省及我国其他地区的分离株有较近亲缘关系。
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山西省运城市2012年蚊媒病毒的分离鉴定
目的 了解山西省运城市蚊虫及蚊媒病毒的种类和分布.方法 2012年8月在山西省运城市临猗县和永济市采集蚊虫标本,经鉴定分类和分批研磨后,利用细胞(C6/36和BHK21)培养方法分离病毒,对阳性分离物使用蚊媒病毒种属特异引物进行RT-PCR扩增鉴定.结果 采集4属7种10455只蚊虫,临猗县和永济市优势蚊种分别为淡色库蚊(91.96％)和三带喙库蚊(72.85％).经鉴定分析,从标本中分离到15株基因I型乙型脑炎病毒(JEV)、4株库蚊黄病毒(CxFV)、3株淡色库蚊浓核病毒(CppDNV)和1株盖塔病毒(GETV).结论 首次从山西省分离GETV和CxFV;三带喙库蚊仍是运城市优势蚊种,目前当地自然循环的JEV仍以基因I型为主.
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我国分离的盖塔病毒衣壳蛋白基因和3'非翻译区分子特征研究
对我国海南省和河北省分离到的3株盖塔病毒(GETV)(M1、HB0215-3和HB0234)进行衣壳蛋白基因和3'UTR区序列测定,并分析比较该病毒的分子生物学遗传特征.首先应用逆转录聚合酶链反应扩增出病毒衣壳蛋白基因和3'UTR片段,纯化后连接到载体中进行测序,然后用Clastal X和DNASTAR软件对测定的核苷酸和推测的氨基酸序列进行比较分析,用MEGA软件绘制系统发生树.3株病毒衣壳蛋白基因分别由801、804和804个核苷酸组成,分别编码267、268和268个氨基酸,3株病毒之间核苷酸和氨基酸序列同源性为97.6%～100%和97.8%～100%,与其他GETV分离株核苷酸同源性在95.4%～99.6%之间.3株病毒3'UTR分别由411、401和401个核苷酸组成,发现中国株存在10个(45～54位)核苷酸缺失和2个(64位、148位)特有的核苷酸位点.进化分析表明盖塔病毒之间的进化关系与分离年代相关,中国境内流行的盖塔病毒是相对独立的一个类群.
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云南省蚊媒病毒分离物的初步鉴定
本研究对前期从云南蚊虫获得的病毒分离物作进一步鉴定，以明确其分类地位。采用甲病毒通用引物进行RT－PCR检测，在5株病毒分离物扩增出目的基因片段。新分离株4株来自三带喙库蚊，1株来自中华按蚊。它们可使白蚊伊蚊细胞（C6／36）、猴肾细胞（Vero）及金黄地鼠肾细胞（BHK－21）发生规律性细胞病变。核苷酸序列分析显示5株病毒与盖塔病毒（ Getah virus， GETV）同源性高，与GETV中国云南YN0540株、河北株 HB0234、海南株 M1及南韩株、 LEIV MPR 株、鹭山病毒的同源性为96．4％～99．2％，5株病毒之间的同源性为98．4％～100％。系统进化分析结果显示，新分离株与上述GETV处于同一进化分支。以上结果证实5株病毒分离物为盖塔病毒。
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湖北省部分地区2010年蚊传虫媒病毒调查
目的：继续调查湖北省蚊媒和病毒种类及其分布状况。方法2010年夏季在湖北省恩施州、神农架林区、江陵县和随州市采集蚊虫标本，用组织培养法分离病毒，用血清学和分子生物学方法对阳性病毒分离物进行鉴定，利用生物信息学软件对新分离病毒进行序列同源性和系统进化分析。结果采集到3属4种12845只蚊虫标本，共分离到38株阳性分离物，经血清学和分子生物学鉴定，32株阳性分离物为流行性乙型脑炎病毒（JEV），5株阳性分离物为盖塔病毒，1株为JEV和盖塔病毒感染混合株。JEV E基因序列进化分析显示新分离JEV均为基因Ⅰ型JEV。盖塔病毒NS2基因序列进化分析显示新分离病毒与中国河北省和韩国毒株同源性高，与俄罗斯分离株进化关系较远。结论首次在湖北省分离到盖塔病毒，并再次在湖北省分离到基因Ⅰ型JEV。
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贵州省2017年蚊虫及蚊传虫媒病毒调查研究
目的 了解贵州省东北部地区蚊虫以及蚊传虫媒病毒的种类及其分布.方法 2017年在贵州省德江、江口县村庄的动物饲养圈使用诱蚊灯采集蚊虫,现场分类并冻存于液氮备用.采集的蚊虫标本在实验室处理后接种BHK-21和C6/36细胞分离病毒,同时进行标本中病毒基因检测.使用生物信息学软件对病毒基因组开展分子遗传学分析.结果 2017年在贵州省德江县龙泉乡居池坝村、青龙镇石打头村、江口县快场村共采集蚊虫3属3种7 380只,其中骚扰阿蚊多,占采集蚊虫总数的61.55％(4 542/7 380),中华按蚊占26.80％(1 978/7 380),三带喙库蚊810只以及其他蚊虫50只.从蚊虫中分离到3株引起组织培养细胞病变的病毒分离物;经分子生物学鉴定,从三带喙库蚊中分离的病毒株GZDJ1765属于Ⅰ型流行性乙型脑炎(乙脑)病毒,另2株病毒株均来自骚扰阿蚊(GZDJ 1746-1、GZDJ 1752-1),经鉴定为盖塔病毒.3批蚊虫(GZDJ1704、GZDJ 1743-2、GZDJ 1751-2)乙脑病毒基因PCR检测均为阳性.结论 贵州省东北部地区所调查的农村地区动物饲养圈骚扰阿蚊为优势蚊种,蚊虫中携带乙脑病毒和盖塔病毒.
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我国盖塔病毒研究概况与进展
我国在1964-2006年共分离到10株盖塔病毒(GETV),它们分别是M1、HB0215-3、HB0234、SH05-6、SH05-15、SH05-16、SH05-17、YN0540、YN0542和GS10-2株.现就我国的这10株GETV分离、鉴定、分布和分子生物学研究结果,以及与国外GETV代表株和鹭山病毒等分子生物学比较结果进行综述.
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贵州省不同地区2008年虫媒病毒调查
目的 调查贵州省不同地区虫媒病毒分布状况,对采集的蚊虫标本进行病毒分离与鉴定.方法 2008年7月在贵州省黔西、德江、榕江和从江县的4个标本采集点使用诱蚊灯采集蚊虫标本,通过组织培养法分离病毒,并对病毒分离物进行血清学和分子生物学鉴定；利用生物信息学技术对新分离病毒的序列进行分析,完成同源性和系统发生分析.结果 采集到3属4种共计9160只蚊虫标本,从中分离到9株病毒,鉴定结果显示8株为盖塔病毒,1株为流行性乙型脑炎病毒(JEV)；贵州省新分离盖塔病毒与原型株相比,核苷酸同源性为94.5％～94.9％,氨基酸同源性为97.4％～97.6％；新分离JEV与基因Ⅰ型JEV的同源性高,系统进化分析结果显示属于基因Ⅰ型JEV.结论 在贵州省分离到盖塔病毒和基因Ⅰ型JEV.盖塔病毒新分离株与我国其他省份分离株进化关系较近；JEV新分离株与四川省分离株进化关系较近.
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甘肃省河西走廊地区2011年蚊虫种类及虫媒病毒调查研究
目的 调查甘肃省河西走廊地区蚊虫种类及所携带虫媒病毒分布状况.方法 使用诱蚊灯于18:00至次日06:00进行蚊虫标本采集,分类鉴定后液氮保存并运送至实验室备检；通过组织培养法分离病毒,并对病毒分离物进行血清学和分子生物学鉴定；利用生物信息学技术对新分离病毒的序列进行分析,完成同源性和系统发生分析.结果 2011年8月在甘肃省河西走廊地区7个县(市)共采集到蚊虫标本3属6种24 028只,其中刺扰伊蚊多,占采集总数的32.80％(7880/24 028),淡色库蚊占30.26％ (7272/24 028)；通过细胞培养分离到1株可以引起两种细胞(BHK-21和C6/36细胞)病变的病毒分离株(GS11-155)；此外在32批蚊虫标本中检测到病毒(库蚊黄病毒、盖塔病毒、辽宁病毒)基因阳性,对其中11批核苷酸序列测定和分析发现,1批为蚊传黄病毒,3批为盖塔病毒,7批为辽宁病毒.结论 甘肃省河西走廊地区优势蚊种为刺扰伊蚊,且蚊虫携带多种虫媒病毒,包括蚊传黄病毒、盖塔病毒和辽宁病毒.
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库蠓中盖塔病毒的分离及其分子鉴定
目的 探讨1株(SZC30)云南省库蠓分离病毒的分类及分子特征.方法 2013年7月采用灯诱的方法在云南省曲靖市师宗县五龙乡采集库蠓,采用BHK-21和C6/36细胞进行病毒分离,阳性分离物脑内接种1日龄乳鼠;分别用甲病毒属和盖塔病毒特异性引物对阳性分离物进行RT-PCR扩增、测序,用Clustal X1.83、BioEdit、DNAStar、Mega5.1等生物信息学软件进行序列分析.结果 采集到库蠓共3 500只,库蠓分为41批进行病毒分离,其中分离到一株病毒(SZC30)对BHK-21与C6/36细胞产生明显病变;分别用甲病毒属和盖塔病毒NS1特异性引物进行RT-P C R扩增结果为阳性;NS1基因序列分析结果显示SZC30株病毒与YN0540及SC1210两株中国分离的盖塔病毒位于同一进化分支内,核苷酸同源性在97％～100％之间,氨基酸同源性在97％ ～100％之间.结论 从云南省采集库蠓中分离到的SZC30株病毒为盖塔病毒.
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四川省首株盖塔病毒SC1210的鉴定
目的 对四川省从蚊虫分离到的病毒SC1210进行鉴定并分析其基因组特征.方法 利用披膜病毒科甲病毒属特异性引物进行RT-PCR鉴定,并采用二代测序平台Ion Torrent PGM进行基因组全序列测定,然后利用Mega Align软件对测定的核苷酸和推测的氨基酸序列进行比较分析,利用Mega 6软件绘制系统发生树.结果 SC1210为盖塔病毒(Getah virus,GETV),该株病毒基因组全长11 690nt,与国内外其他分离株的核苷酸同源性为99.2％-99.7％,氨基酸同源性为96.5％-99.4％.衣壳蛋白全长为804nt,编码268个氨基酸,与其他株的核苷酸同源性为94.9％-99.2％,氨基酸同源性97％-99.6％.E2基因全长1 266 nt,编码422个氨基酸,与其他株的核苷酸同源性为94.6％-99.6,氨基酸同源性为97.1％-99.5％.3'UTR全长402 nt,具有GETV病毒独特的3个完整的重复序列元件和19 nt的保守序列.结论 四川省分离到的首株GETV SC1210与云南分离株YN0540亲缘关系较近,而与马来西亚原始株MM2021亲缘关系较远.
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我国新分离盖塔病毒的部分基因组分子特征研究
目的 通过分子生物学方法研究我国山东省2008年分离的盖塔病毒(DY0824)基因组分子生物学特征.方法 应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出结构区基因和3' UTR片段,连接到载体中进行序列测定,然后用Clustal X1.83和MegaAlign软件对测定的核苷酸和推测的氨基酸序列进行比较分析,用Mega4软件绘制系统发生树.结果 DY0824病毒株衣壳蛋白由804个核苷酸组成,编码268个氨基酸,与国内外其他分离株的核苷酸同源性为95.4%～99.9%,氨基酸同源性为97.4%～100%.E2蛋白全长1266个核苷酸,编码422个氨基酸,与其他株的核苷酸同源性为94.8%～99.5%,氨基酸同源性为97.6%～100%.该病毒3' UTR由401个核苷酸组成,存在3个重复序列.结论 山东省新分离盖塔病毒衣壳蛋白和E蛋白基国与该病毒原型分离株相比分别存在7个和10个氨基酸差异位点,病毒3'UTR区域存在多个核苷酸差异位点.
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WJBC株盖塔病毒基因组序列测定及与其他甲病毒的系统进化关系
目的 对WJBC株盖塔病毒(GETV)进行基因组序列测定,阐明其与已报道的GETV及其他甲病毒的关系.方法 将GETV基因组编码区分12段分别进行RT-PCR扩增,将扩增产物直接进行测序,非编码区采用RACE法进行扩增,扩增产物纯化后连入pGEM-T easy载体,经转化DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆鉴定后测序,应用DNAStar软件将测序结果拼接获得基因组序列.结果 与结论 GETV基因组核苷酸共11 696 nt,编码3721个氨基酸,非结构基因编码2468个氨基酸,结构基因编码1253个氨基酸,结构基因和非结构基因之间有44 nt的连接区为非翻译区.病毒基因组5′端和3′端分别有78、411 nt的非编码区.序列同源性分析结果表明,此株病毒与M1株盖塔病毒同源性高,两者核苷酸序列同源性为99.8%,氨基酸序列同源性为99.2%.
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盖塔病毒分子进化及其迁徙
目的 了解世界各地分离盖塔病毒分子进化特征及其时空迁徙.方法 用Clustal X1.83、MegaAlign和Gene DOC软件对测定的核苷酸和推测的氨基酸序列进行比较分析,用MEGA 6.0软件绘制系统发生树,采用BEAST v 1.8.1软件包里的Bayesian Stochastic Search Variable Selection(BSSVS)程序进行盖塔病毒的空间动力学分析.结果 盖塔病毒E2基因全长均为1 266 nt,编码422 aa,其核苷酸和氨基酸同源性分别为94.5％～100％和96.4％～100％.病毒分子进化分析发现,盖塔病毒不存在蚊虫,马匹和猪等宿主动物和媒介的种属和地域分布差异.生物信息学分析结果显示,盖塔病毒起源于马来西亚,此后依次传播至日本、中国、韩国以及蒙古国和俄罗斯等地.结论 自1955年首次分离盖塔病毒至2014年间分离的盖塔病毒E2基因序列较为稳定,未发现病毒基因组之间存在种属及地域分布差异,并且该病毒已经从热带地区传播到欧亚大陆多个国家和地区,因此加强盖塔病毒及人畜动物感染的检测和监测至关重要.
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云南腾冲县新分离乙型脑炎和盖塔病毒的分子生物学特征
目的 分析云南省腾冲县新分离流行性乙型脑炎病毒(JEV)和盖塔病毒(GETV)的分子生物学特征.方法 2007年7月在中缅边境地区腾冲县采集蚊虫标本,用BHK-21和C6/36细胞分离病毒,阳性分离物用RT-PCR方法进行鉴定,用相关生物学软件进行分子生物学特征分析.结果 从腾冲县采集的4属25种26 702只蚊虫中分离到20株JEV,1株GETV.系统进化分析表明,新分离20株JEV均属于基因Ⅰ型,与邻近省份和东南亚流行株亲缘关系较近;PreM和E基因核苷酸同源性和氨基酸位点分析表明,这20株JEV之间及其与国内外流行株间均存在一定差异,但它们的抗原和毒力位点未发生明显改变.本次分离的GETV的Capsid基因和E2基因与其他国内外分离株的同源性较高.结论 首次证实云南省西部地区存在基因Ⅰ型JEV和GETV流行,这些流行株具有较为稳定的遗传特征和地域特征.
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甘肃省天水及陇南部分地区虫媒病毒调查
目的 对甘肃省天水陇南部分地区的吸血蚊虫进行病毒分离与鉴定.方法 2006年8月在当地采集蚊虫标本,分离病毒和对病毒分离物进行血清学和分子生物学鉴定,以软件进行病毒的核苷酸序列比对和系统发生分析.结果 分离到19株病毒,鉴定结果 显示分离株GS10-2为盖塔病毒,GS42-2为版纳病毒,其余分离株为一种基因组约8 000核苷酸的未知RNA病毒.盖塔病毒分离株3'UTR中具有与已往中国分离株相同的缺失序列和3个特异核苷酸位点.版纳病毒分离株基因组第12片段的进化关系同其它中国分离株有明显差异,位于一条独立的进化枝中.结论 在该地区分离到1株盖塔病毒、1株版纳病毒和17株未知RNA病毒;盖塔病毒与以往我国分离株的遗传关系密切,版纳病毒与我国其它地区分离株有明显差异,在进化上相对独立.
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在我国北方涉县首次检测到盖塔病毒
目的:确定从河北省涉县蚊体中分离到的病毒种类.方法:采集三带喙库蚊标本,液氮运输和保存,10只为一组研磨后接种C6/36细胞分离病毒.病毒株分别采用乙醚试验、免疫荧光试验和分子生物学试验进行毒株鉴定.结果:采集到蚊标本1290只,标本处理后接种细胞47批,病毒分离结果得到13株阳性分离物(毒株),经乙醚试验和免疫荧光试验初步鉴定HB0215-3和HB0234两株病毒为披膜病毒科甲病毒属成员,再经RT-PCR、核酸序列测定和分析,证实两株病毒核酸与国际基因库中的AY702913和NC-006558盖塔病毒同源性高,被进一步鉴定为盖塔病毒.结论I该研究从河北省涉县三带喙库蚊中分离到了盖塔病毒,这是我国内陆地区北方首次分离到.
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河北省涉县发烧样病人盖塔病毒IgM抗体筛查
目的:了解涉县夏季发烧样病人中盖塔病毒感染情况.方法:采用抗体捕捉ELLSA方法检测盖塔病毒IgM抗体.结果:涉县发烧样病人盖塔病毒IgM抗体阳性率0.63%(2/317).结论:涉县夏季发烧样病人中存在盖塔病毒感染,但感染率很低.
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云南白纹伊蚊盖塔病毒的分离鉴定
目的:对我国云南省边境线获得的未知病毒进行分离鉴定.方法:将样本进行随机聚合酶链式反应,纯化链接到载体中进行序列的测定,确定病毒为甲病毒属类盖他病毒,然后用特异性引物进行衣壳蛋白基因和3'UTR区序列进行DNA测序,分析比较该病毒的分子生物学遗传特征,绘制系统发育树.结果:该病毒为盖塔病毒.结论:该病毒与韩国分离株和河北两株亲缘关系较近,而与MM2021马来西亚原始毒株亲缘关系较远.
