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人纤溶酶原K5突变体在大肠杆菌中的优化表达
[目的]提高K5突变体(mK5)在原核系统的单位表达量.[方法]调整可能影响表达的参数:抗生素浓度、pH、A600值、IPTG终浓度、诱导时间、诱导温度,同时固定其它参数.通过电泳分析,获得mK5在原核系统pET22b-BL21的优表达条件:组氨酸结合柱亲和层析、纯化获得mK5蛋白,SDS-PAGE和Western-blot方法鉴定mK5蛋白;MTT法分析mK5对人视网膜毛细血管内皮细胞(HRCEC)增殖的影响.[结果]优化后的表达条件为:适细菌培养温度为37℃,佳抗生素浓度为50 μg/mL羧苄青霉素,适pH值为7.0,在A600为0.9～1.0时加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG为佳诱导条件,37℃诱导10 h为佳诱导时间;优化条件后inK5纯化蛋白得率为21 mg/L,产量较优化前(15 mg/L)提高近30%;inK5特异性地抑制HRCEC的增殖,IC50=40 nmol/L.[结论]本研究确定了mK5蛋白诱导表达的适参数,并获得具有生物活性的高纯度、高表达量的重组蛋白.为工业化大规模发酵生产提供了基本参数.
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人纤溶酶原K5基因的结构改造及其在大肠杆菌中的表达、纯化与鉴定
目的 改造人纤溶酶原Kringle 5(K5)基因,构建RGDRGD-liteK5融合表达质粒,并表达纯化所得RGDRGD-liteK5蛋白.方法 以入纤溶酶原K5 cDNA为模板,通过PCR得到RGDRGD-liteK5基因片段,并克隆到质粒pGEXl-λT中,构建重组原核融合表达载体pGEX-RGDRGD-liteK5;在IPTG诱导下,观察融合蛋白在大肠杆菌Rosetta中的表达情况;利用亲合层析柱纯化表达产物,用Western blot分析鉴定表达产物.结果 PCR扩增得到274 bp的片段,并成功插入pGEX1-λT质粒;含重组质粒的大肠杆菌在IPTG诱导下表达了特异性的融合蛋白,其分子量为36 kD;获得的融合蛋白经凝血酶酶切后,得到了分子量约为10 kD的RGDRGD-liteK5蛋白;Western blot证实了表达产物的正确性.结论 成功地改造了人纤溶酶原K5基因,构建了重组融合表达质粒pGEX-RGDRGD-liteK5,并纯化了其表达产物.
