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幽门螺杆菌ureB及ureB-hspA融合基因在减毒鼠伤寒沙门菌中的表达及小鼠的免疫应答
目的构建H.pylori ureB单基因及ureB和hspA融合基因的减毒鼠伤寒沙门菌疫苗候选株,并进行初步的免疫原性分析. 方法将H.pylori ureB单基因及ureB和hspA融合基因分别克隆入pTrc99A-asd质粒的多克隆位点之内.挑取单菌落质粒鉴定后,分别将其电击经中间宿主X3730转入终宿主X4072,SDS-PAGE和Western blot检测蛋白表达.将疫苗候选株经口或鼻免疫BALB/c小鼠. 结果疫苗候选株能够分别表达出相对分子质量(Mr)为64×103的UreB蛋白及77×103的UreB-HspA融合蛋白.在免疫BALB/c小鼠的肠液和血清中可以分别检测到针对H.pylori的特异性分泌型IgA和IgG抗体. 结论构建了能够表达幽门螺杆菌UreB及UreB-HspA融合蛋白的活菌疫苗候选株,为探索制备H.pylori口服活菌疫苗奠定了基础.
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幽门螺杆菌HspA和UreB双价侯选疫苗株的构建
目的 构建表达幽门螺杆菌的组成成分热休克蛋白A亚单位(HspA)和尿素酶B亚单位(UreB)的重组蛋白质的侯选菌株.方法 用PCR方法从幽门螺杆菌的染色体DNA上分别扩增出HspA和UreB基因片段,将它们融合插入原核表达载体pET-22b(+)中,并在BL21(DE3)大肠杆菌表达.结果 经测序,HspA-UreB(HU)融合基因片段由2061bp组成,为编码687个氨基酸残基的多肽.SDS-PAGE和免疫印迹分析检测发现,融合基因表达的蛋白相对分子质量约为78×103,并证实该重组蛋白可以被幽门螺杆菌感染阳性患者的血清所识别,其免疫小鼠所得血清抗体可与纯化的HspA和UreB重组蛋白单体或融合体发生特异性的结合反应.同时观察到HspA的存在可使融合蛋白的尿素酶活性增加2倍以上.结论 HspA-UreB融合蛋白有可能作为一种有效的蛋白质疫苗用于幽门螺杆菌感染的预防和治疗.
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幽门螺杆菌UreB与大肠杆菌LTB基因融合及表达的研究
目的构建和表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(UreB)与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的重组融合蛋白,并对其基本的生物学及免疫学特性进行研究.增出1713bp的ureB基因,并克隆至pFS2.2载体中与ltB基因融合,将ltB-ureB融合基因插入改造后的原核表达载体PinPointTMXa-Ⅱ,并在工程菌E.coli 方法采用PCR技术从幽门螺杆菌染色体DNA中扩JM109中诱导表达.因由2103个碱基组成,为编码701个氨基酸残基的多肽.SDS-PAGE和Western 结果经序列分析,ltB-ureB融合基blot检测发现,融合蛋白的相对分子质量(Mr)约为75×103,并与幽门螺杆菌感染的阳性血清发生抗原抗体反应,ELISA检测显示,融合蛋白中存在LTB组分.同时发现所表达的融合蛋白无尿素酶活性,但保持与LT受体-神经节苷脂GM1结合的活性.结论 LTB-UreB融合蛋白有可能用于幽门螺杆菌基因工程疫苗的研究.
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幽门螺杆菌热休克蛋白A与尿素酶B融合表达产物的初步纯化及其在小鼠体内免疫效应活性分析
目的:探讨幽门螺杆菌热休克蛋白A与尿素酶B融合蛋白的免疫生物学活性.方法:采用亲和层析、离子交换和凝胶过滤对幽门螺杆菌热休克蛋白A与尿素酶B融合蛋白进行初步纯化,用粗纯化蛋白对小鼠进行免疫,然后分析其免疫活性.结果:采用亲和层析或离子交换和凝胶过滤后,融合蛋白的纯度分别可达到65.6%和90.2%.该融合蛋白可诱导小鼠产生抗幽门螺杆菌的胃肠黏液IgA和血清IgG抗体,并促使免疫小鼠脾脏T淋巴细胞CD4+/CD8+比值的增加.结论:重组热休克蛋白A与尿素酶B融合蛋白可以诱导在未来免疫预防中起积极作用的免疫应答反应.
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抗幽门螺杆菌尿素酶B单抗对人血小板聚集与活化的影响及其机制研究
目的研究抗幽门螺杆菌尿素酶B(Hp ureB)单克隆抗体(1F11)对二磷酸腺苷(ADP)诱导的人血小板聚集与活化的影响及其机制.方法采用Western blot分析血小板膜糖蛋白(GP)成分与1F11的相关性,采用比浊法检测血小板聚集情况,分别用双抗夹心、抗原竞争的酶联免疫测定法检测各组血浆中的P-选择素、血栓烷B2.通过流式细胞术(FCM)分析单抗1F11与SZ21单抗对血小板GPⅢa的竞争性.结果1F11与血小板成分GPⅢa有一定程度结合,1F11单抗可明显抑制ADP诱导的人血小板的聚集,随着1F11浓度的增加,血小板聚集抑制率呈剂量依赖性增高,但1F11并不抑制血浆中P-选择素、血栓烷B2的水平.FCM结果显示:加单抗1F11后可使FITC-SZ21单抗与血小板结合的阳性细胞率从99.5%降至77.4%.结论1F11可与人血小板GPⅢa结合并抑制血小板聚集,但不能阻止血小板的活化过程.Hp ureB与人血小板GPⅢa具有交叉识别的抗原表位,提示幽门螺杆菌可能与ITP发病有关.
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幽门螺杆菌尿素酶B在乳酸乳球菌中表达与优化
目的 探讨幽门螺杆菌尿素酶B(UreB)在食品级乳酸乳球菌NZ3900菌株中的优化表达条件.方法 利用基因重组技术构建乳酸乳球菌NZ3900( pNZ81 10/ureB)；采用L25(56)正交表设计,选定诱导剂浓度、诱导时机、诱导时间3个因素各5个水平；采用乳酸链球菌素诱导表达后,检测不同组合的UreB在乳酸乳球菌中的表达,凝胶扫描后用Genetools分析软件进行目的蛋白占细菌总蛋白比例分析；应用极差分析法比较影响蛋白表达的因素主次关系及目的蛋白优化表达条件；应用正交试验方差分析法进行方差分析.结果 乳酸乳球菌重组子NZ3900( pNZ8110/ureB)表达的可溶性UreB蛋白高可达27.26 μg/mL,占上清总蛋白比例高可达20.19%；3个因素对UreB蛋白表达量的影响大小依次为诱导时间、诱导时机和诱导剂浓度,方差分析结果显示,诱导时间对UreB蛋白表达的影响具有统计学意义(P＜0.05).结论 应用正交试验法获得UreB蛋白在乳酸乳球菌中的优化表达条件,为进一步评价免疫预防抗幽门螺杆菌感染的效果奠定基础.
关键词： 幽门螺杆菌 乳酸菌 乳酸链球菌肽翻译融合表达系统(NICE) 尿素酶B 优化表达 -
特异性抗原幽门螺杆菌尿素酶B的体外表达
目的:建立自患者体内分离的幽门螺杆菌菌株及其抗原尿素酶B(ureB)体外表达的方法.方法:分离培养胃病患者感染的幽门螺杆菌,采用基因体外重组技术分离ureB基因,并经测序鉴定,所表达的抗原蛋白用Western blot进行鉴定.结果:测序结果证实克隆的基因与GeneBank中的序列相符,经Western blot证实获得ureB的重组蛋白.结论:获得了高表达的重组抗原蛋白,为ureB检测及Hp感染的诊断提供了物质基础.
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抗幽门螺杆菌单克隆抗体与人血小板交叉识别的实验研究
目的:研究抗幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B(ureB)单克隆抗体与血小板膜糖蛋白(GP)的结合情况.方法:运用Western blot、流式细胞术(FCM)和免疫放射法(IRMA)分析血小板膜GP成分与幽门螺杆菌ureB成分的相关性.结果:抗幽门螺杆菌ureB单抗1F11与血小板成分GPⅢa、P-选择素有一定程度结合,但与GPⅠb、GPⅡb及GPⅥ无结合.结论:血小板成分GPⅢa、P-选择素与幽门螺杆菌ureB存在交叉识别的共同抗原表位,提示Hp感染与部分特发性血小板减少性紫癜(ITP)的发病机理有关.
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茅苍术挥发油对幽门螺杆菌及其尿素酶B表达的影响
目的 研究茅苍术挥发油对幽门螺杆菌(HP)的抑制作用以及亚小抑菌浓度(sub-MIC)挥发油对HP毒力因子尿素酶B(UreB)表达的影响.方法 将实验分为阳性对照组(加入100 μL HP菌悬液),溶剂对照组(加入100 μL HP菌悬液和0.25 μL二甲基亚砜),30.000、15.000、7.500、3.750、1.875、0.938、0.469 g·L-1茅苍术组(分别加入30.000、15.000、7.500、3.750、1.875、0.938、0.469 g·L-1茅苍术挥发油和100 μL HP菌悬液)和空白对照组(加入培养基),运用常规肉汤稀释法测定茅苍术挥发油对HP的抑制作用.将2×1010 CFU·L-1 HP接种于布氏肉汤液体培养基,然后分为实验组和空白对照组,实验组加入茅苍术挥发油使其终浓度为0.5×小抑菌浓度,对照组不加茅苍术探发油,微需氧培养72 h后,采用实时定量荧光聚合酶链式反应检测2组尿素酶B(UreB) mRNA的表达.结果 溶剂对照组和0.469 g·L-1茅苍术组抑制率与阳性对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).30.000、15.000、7.500、3.750、1.875 g·L-1茅苍术组抑制率高于阳性对照组,0.938 g· L-1茅苍术组抑制率低于阳性对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05).实验组UreB mRNA表达量为0.036±0.001,低于对照组的0.100 ±0.001,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 一定浓度的茅苍术挥发油可抑制HP生长,亚抑菌浓度挥发油可下调UreB mRNA表达.
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幽门螺杆菌尿素酶B基因的克隆、表达及其抗原性的鉴定
目的构建含人幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)尿素酶B(Urease B,UreB)编码基因的重组质粒,测定、分析其核苷酸序列,并在E.coli Top10中表达,研究其抗原性.方法应用PCR技术从Hp DNA染色体中扩增UreB编码基因片段,将其T-A克隆和测序,并与GenBank公布的其它Hp菌株基因序列比较,再将目的基因克隆至表达载体pGEX-4T-1中进行表达,用GST亲和层析对其进行纯化,纯化产物用于对29株小鼠抗Hp-全菌单克隆抗体(mAb)的鉴定及与Hp感染患者血清进行Western blot.结果扩增的UreB基因全长1 704 bp,并在GenBank上登录(No.DQ141576),与GenBank公布的其它Hp菌株的核酸同源性为97%～99%,表达的UreB融合蛋白的相对分子量为91 000.29株小鼠抗Hp-全菌mAb中有6株是针对UreB抗原的,纯化产物可被病人血清和抗UreB的鼠单克隆抗体识别.结论重组UreB具有较好的抗原性,为Hp检测诊断和疫苗的研究奠定了基础.
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幽门螺杆菌尿素酶B亚单位功能片段的纯化及活性研究
目的 建立一种有效的尿素酶功能片段的纯化方法.方法 应用已构建的尿素酶B功能片段表达载体,IPTG诱导表达,包涵体鉴定试验判断目的蛋白表达形式,AKTA100上分别采用亲和层析和离子层析等多级纯化方式优化纯化条件,HPLC检测纯化蛋白纯度,尿素酶活性阻断试验对纯化后功能片段进行活性鉴定.结果 IPTG诱导后目的蛋白高表达,包涵体鉴定试验证实目的蛋白以可溶形式存在宿主细胞中,优化后方案得到目的蛋白纯度＞90%且能被尿素酶B免疫的兔血清识别,纯化后蛋白免疫家兔后产生兔抗血清能够特异性中和Hp尿素酶活性.结论 成功建立了尿素酶功能片段的纯化方法.
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人幽门螺杆菌尿素酶抗体诊断试剂盒的研制
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H.pylori)为慢性胃炎、消化性胃溃疡的致病菌，并且与胃癌的发生密切相关，世界卫生组织(WHO)将其列为一级致癌因子，早期诊断H.pylori感染并对其治疗和预后的观察具有重要意义。目前，临床上用于诊断H.pylori感染的方法主要有胃镜下组织活检、细菌培养、13C呼气试验等，前者需活检组织，病人痛苦大，且阳性率低，后者需特殊性设备，不易推广，细菌培养则阳性检出率低，而血清学诊断具有灵敏、快速、准确、简便、费用低等优点，易在临床上广泛使用。
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幽门螺杆菌尿素酶B基因的克隆与高效表达
目的克隆并表达幽门螺杆菌尿素酶B基因.方法提取幽门螺杆菌染色体DNA,用PCR方法扩增尿素酶B基因.将其克隆至表达载体pQE30,转化大肠杆菌M15,IPTG诱导表达.结果分离得到了1.7kb的ureB基因片段,并在大肠杆菌中实现了该基医的高效表达.在37℃诱导表达4h后,表达产物约占细菌总蛋白的34.0%.表达以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在,其中主要包涵体的形式,目的蛋白占不溶性蛋白的55.8%.结论幽门螺杆菌ureB基因的克隆与表达为Hp疫苗的研制打下了基础.
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用单表位合成肽抗原荧光偏振免疫法检测抗幽门螺旋杆菌尿素酶的抗体
目的:应用单表位合成肽抗原,建立一种新的基于荧光偏振技术(fluorescence polarization,FP)的抗体检测方法.方法:用幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,Hp)尿素酶B(UreB)的单表位合成分支肽抗原免疫小鼠,以ELISA法分析免疫的效果.分析FITC标记的合成肽抗原在不同浓度时的FP值,用FP技术分析抗原表位的抗原性以及不同稀释比例的血清样品对FP检测的影响.分别应用FPIA法和ELISA法,对126例样品进行Hp感染检测,对FPIA的检测数据进行受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)分析.结果:UreB的单表位抗原肽具有较强的抗原性和免疫原性;1.0nmoL/L的FITC标记肽可用于FPIA检测,血清样品做1:25稀释时可明显区分阳性和阴性检测结果.与ELISA方法检测的结果相比较,用基于UreB单表位合成肽抗原的FPIA法检测Hp感染的灵敏度为85.7%,特异度为98%.结论:应用UreB单表位合成肽抗原,可对抗UreB的抗体进行快速FPIA检测,用此法检测抗体在疾病的临床诊断中具有广阔的应用前景.
