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云南省边境地区禽流感H5N1亚型病毒基质蛋白2基因进化分析
目的 了解2008-2012年云南省边境地区禽流感H5NI亚型病毒基质蛋白2(M2)和离子通道蛋白基因变异特征及遗传进化关系.方法 于2008-2012年采集云南省边境地区(越南、老挝、缅甸与云南省交界处)家禽和野生鸟类棉拭子样品1240份,经H5N1亚型特异性多重RT-PCR检测,对阳性样品病毒M基因进行扩增,克隆至pMD18-T载体测序,获得M2基因序列,并与已知参考毒株序列进行序列比对及系统发育分析.结果 自1240份样品中检出H5N1亚型阳性样品71份,阳性率为5.72％；选择其中的30份阳性样品进行病毒M2基因测序,共获得14种不同序列,存在3个不同进化分支:1.2.1、1.2.2、2,各有5、7、2份.通过基因系统发育分析发现,M2基因与HA基因呈现不同进化关系；M2蛋白涉及表位、金刚烷胺抗性和禽源、人源毒株的关键性氨基酸位点存在替代或突变.结论 2008-2012年期间云南边境H5N1亚型病毒M2基因具有遗传差异,M2基因进化分支1.2.2毒株已成为当地流行的优势毒株.
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1998～2002年广州地区儿童B型流感病毒亚型监测
目的了解1998～2002年广州地区儿童B型流感病毒的亚型流行分布和特点.方法对疑似流感样症状的儿童取咽分泌物,接种到MDCK放33℃温箱培养48～72小时.MDCK细胞上清液进行血凝试验.结果 2848例中117例分出B型流感病毒,总阳性率为4.1%.1998年为5%,1999年B型流感病毒阳性率为1.9%,2000年为4.3%,2001年为3.3%,2002年为6.1%.1998～2001年广州地区儿童B型流感病毒流行为Yamagata型,2002年为Victoria型.结论 1998～2002年广州地区儿童B型流感病毒存在两个亚型感染,但没有发现2个亚型在同一流行时间同时出现.2002年广州地区儿童发生B Victoria型大流行.
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流感病毒型别及亚型的多重RT-PCR方法快速检测
目的为适应流感疫情监测中快速诊断的需要,建立敏感特异的流感病毒多重逆转录PCR(MRT-PCR)检测方法.方法对甲1型(H1N1)、甲3型(H3N2)、乙型流感病毒的血凝素(HA)基因保守区域分别设计引物进行MRT-PCR.另设计了两对引物对H1N1和H3N2亚型流感病毒的神经氨酸酶(NA)N1、N2作亚型判断.结果MRT-PCR可特异性检测出各型流感病毒的目的片段,相互间无交叉反应.二次PCR反应后对H1N1、H3N2流感病毒的检测灵敏度可达0.10 TCID50/50μl以下,对乙型流感病毒的检测灵敏度可达0.01 TCID50/50μl以下.应用此方法也可特异性地检测出H1N1和H3N2流感病毒的NA基因.结论用MRT-PCR从临床患者含漱液标本中检出相关流感病毒的灵敏度要高于用狗肾传代细胞(MDCK)或鸡胚分离的灵敏度,达到了快速、敏感、正确检测流感病毒及其亚型的目的.
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2000～2002年我国流行的甲3(H3N2)亚型流感病毒抗原性及基因特性的研究
目的了解2000～2002年我国流行的甲3流感病毒HA基因突变及其抗原变异情况.方法鸡胚传代流感病毒,收获尿囊液作为抗原性分析抗原并提取病毒的RNA,进行逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR),扩增产物用纯化试剂盒纯化后测序,用MegAlign软件进行基因种系发生树分析.结果与A/武汉/359/1995(H3N2)、A/Sydney/5/1997(H3N2)相比,2000～2002年我国分离到的甲3亚型流感病毒的血凝素重链区氨基酸序列存在差异.2001～2002年分离到的甲3毒株与2000年分离出的毒株的血凝素蛋白重链区(HA1)氨基酸序列有4个位点差异,它们分别位于83、186、202和222位,其中83和186分别位于抗原决定簇E和B区,其余均位于受体结合位点(RBS)的左臂.结论2000～2002年分离到的甲3亚型流感病毒的基因特性发生突变并导致其抗原性发生漂移.
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高致病性禽流感病毒H5N1安徽株A/Anhui/1/2005感染人肺癌上皮细胞(A549)的差异表达分析
目的 筛选人细胞中与高致病性禽流感病毒致病相关的基因,探讨高致病性禽流感病毒的致病机理.方法 分别用高致病性禽流感病毒安徽株和普通人流感病毒H1N1株分别感染人肺癌上皮细胞,通过人类全基因表达谱芯片技术对不同时段感染细胞进行差异表达分析,筛选出与高致病性禽流感病毒感染相关的候选基因,以实时定量荧光PCR法验证差异表达基因.结果 获得了不同致病性流感病毒感染细胞后的差异表达谱,验证了细胞凋亡通路、mTOR通路中以及与免疫相关的16个基因的差异表达.结论 H5N1感染后与普通人流感病毒H1N1相比具有促进细胞凋亡的趋势.
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甘肃省2000-2007年度流感监测结果分析
目的 掌握我省流感流行情况,为流感防治提供依据.方法 按照国家流感监测方案,在6所国家级哨点医院门诊内、儿科开展流感样病例的监测和在全省开展流感暴发疫情的监测,采集流感样患者的鼻咽拭子标本,用MDCK细胞或鸡胚进行流感病毒分离与鉴定.结果 2000-2007年,哨点医院流感样病例占门诊就诊人数的5.16%,从国家级监测哨点医院及暴发疫情共采集标本6383份,分离出流感病毒943份,分离率14.77%,其中H1N1亚型218株,H3N2亚型352株,B型(Victoria系)312株,B型(Yamagata系)61株;全省发生的61起疑似流感疫情暴发,经实验室检测44起确定为流感暴发,其中38起为B(victoria)亚型流感病毒,3起为H3N2亚型、2起为B型(Yamagata系)、1起为H1N1亚型.结论 流感每年均会在人群中活动,冬季以甲型流感为主;2005-2007年,每年3-6月份B型(Victoria系)是造成学校、幼儿园等集体单位暴发的主要病毒.
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流感病毒血凝素基因工程抗体的抗病毒实验效果观察
目的对昆虫细胞系统表达纯化的中和性流感病毒血凝素基因工程全抗体IgG-IV-2,IgG-IV-6进行体外和体内抗病毒效果的研究.方法对比抗体应用前后病毒在MDCK细胞中的病毒滴度和动物模型中粘膜用药前后鼠肺内病毒滴度的改变,验证抗体的粘膜抗感染效果.结果两株基因工程抗体使4.5 log10TCID50 滴度的病毒下降1/2的剂量分别为0.8 μg和0.5 μg;动物模型的粘膜给药表明使4.0 log10TCID50的病毒下降1/2所需的抗体剂量IgG-IV-2为0.25 mg/kg体重,IgG-IV-6为0.1 mg/kg体重,联合应用时为0.08 mg/kg体重.结论获得的基因工程抗体具有体内体外的抗病毒效果,能够中和病毒毒力.
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无锡地区流感病毒病原学监测及H3亚型血凝素基因变异研究
目的 监测无锡地区2005年至2008年季节性流感型与亚型分布并了解2008年部分A/H3N2分离株血凝素(8A)基因变异状况.方法 无锡地区医院门诊流感样患者及集体单位聚集性流感样暴发患者采集鼻咽拭标本,接种MDCK细胞,采用标准抗血清鉴定阳性分离株型与亚型,并对2008年部分H3亚型流感病毒进行HA全基因测序,分析HA基因变异状况.结果 2005年至2008年9月,在无锡地区流感样患者中共分离到435株流感病毒,其中164株为A/H1N1亚型,80株为MH3N2亚型,B型191株.型与亚型有明显季节性分布强弱特征.H3亚型HA序列分析,无锡地区9株分离株与上海地区同期分离株接近,有很多序列相互穿插归属于进化树的同一分支,与WHO 2008-2009年疫苗推荐株相近.结论 近年无锡地区散发和局部暴发流感病毒感染仍主要为A/H1N1、A/H3N2和B型,A/H3N2 HA基因与上海地区同期分离株接近,与WHO 2008-2009年疫苗推荐株相近.
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应用酵母双杂交系统筛选与乙型流感病毒BM2相互作用的蛋白质
目的筛选与乙型流感病毒BM2蛋白相互作用的蛋白质.方法应用酵母双杂交系统,以BM2(26-109)插入载体pGBK T7作为诱铒,在四缺培养基上筛选人Kidney MATCHMAKER cDNA文库,寻找与BM2蛋白相互作用的宿主蛋白.结果筛选得到6个阳性AD/文库质粒,并用酵母双杂交实验验证了阳性AD/文库质粒与BM2的相互作用.将阳性AD/文库质粒测序并对测序结果做BLAST分析,发现它们分别是N-乙酰神经氨酸酶丙酮酸裂解酶,Angiopoietin 3、锌指蛋白251、核糖体蛋白S20、蛋白精氨酸N-甲基转移酶1(PRMT)、转录因子样1(TCFL1).结论BM2能与这些转录翻译功能相关的蛋白质相互作用,表明BM2蛋白在病毒生活周期中发挥重要作用.
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甲型流感病毒荧光RT-PCR检测方法的设计和检定
目的设计甲型流感病毒TaqMan荧光RT-PCR检测方法并对其进行检定.方法用DNA Star和Primer Premier 5.0软件设计甲型流感病毒荧光PCR检测所用引物和探针;在GenBank中进行Blast以及电子对比证明其具有高度的特异性和保守性;和标准RT-PCR进行比较,检测此方法的灵敏度.结果所设计的引物和探针高度特异和保守,灵敏度比标准RT-PCR方法高3～27倍,并且反转录和PCR可合并为一步.结论设计了甲型流感病毒TaqMan检测方法;该方法具有特异、灵敏和简便的特点.
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流感病毒中和性基因工程Fab抗体的研制
目的获得基因工程抗流感病毒抗体，为检测其粘膜用药在动物模型中的抗病毒效果奠定基础。方法 从酶联免疫吸附试验阳性的人外周血中分离淋巴细胞，提取总RNA，Oligo\|Dt逆转录Cdna，聚合酶链反应扩增人IgG轻、重链基因，利用pComb3载体构建噬菌体抗体库。用纯化的流感病毒A/Sydeny/5/97(H3N2)为固相抗原筛选抗体Fab段，并在大肠埃希菌中进行分泌性表达。通过血凝抑制实验、免疫荧光实验和病毒中和实验选择具有中和作用的Fab抗体。结果 分离到两株Fab克隆，IV-2和IV-6，流感病毒抗原和抗Fab抗体直接ELISA检测阳性，间接免疫荧光实验呈阳性。它们都具有血凝抑制作用，病毒中和实验显示能使病毒滴度下降30倍和20倍。结论 获得了两株具有病毒中和活性的人源抗流感病毒悉尼株的Fab段抗体，为进一步的表达纯化及粘膜给药研究其抗病毒效果提供材料。
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1998～2002年广州地区儿童流感病毒检测与分析
目的了解广州地区儿童是否有禽流感感染和近年流感病毒感染的流行情况.方法对儿童采取咽拭子分泌物,接种到MDCK细胞.放33℃温箱培养.MDCK细胞上清液进行血凝试验.结果 2 376例中210例分出流感病毒,流感病毒分离总阳性率为8.8%.1998年3月～1999年2月,年度流感病毒分离阳性率为15.1%,H3N2是优势株.1999年3月～2000年2月,年度流感病毒分离阳性率为7.2%,出现H3N2、H1N1和H9N2以及B型多种流感病毒感染亚型特点.2000年3月～2001年2月,年度流感病毒分离阳性率为6.9%.2001年3月～2002年2月,年度流感病毒分离阳性率为4.3%.1999年检出H9N2 禽流感病毒1株,患儿血清对H9N2血凝抗体1∶400抗体升高.结论 1998年3月～2002年2月, 广州地区主要存在三种流感病毒,1998～2000年,以H3N2流感流行为主,但2000年起出现H1N1流感病毒,而H3N2呈逐年下降.B型流感病毒呈散发流行.1999年广州市儿童曾出现禽流感病毒感染个案.
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天津市2001年-2004年流感病原学监测分析
目的:观察天津市流感病毒流行特点以及发生禽流感疫情时的情况.方法:2001年10月-2004年3月3个冬春季的类流感患者咽拭子标本采用MDCK细胞和鸡胚双腔法分离流感病毒,用鸡红细胞和豚鼠红细胞凝集试验(HA)证实是否存在病毒,再用红细胞凝集抑制试验(HI)进行型和亚型的鉴定.2004年用RT-PCR方法检测禽流感疫情区发热患者咽拭子标本.结果:3个监测周期共采集类流感样患者咽拭子标本953份,分离出流感毒株285株,总检出率为29.9%,男女比例为1.06:1,其中A(H1N1)亚型4.6%(13/285株),A(H3N2)亚型59.6%(170/285株),B型35.8%(102/285株).285株流感病毒都能适应MDCK细胞,但阳性标本液直接接种鸡胚阳性率极低,仅为2.1%(6/285).21份禽流感监测咽拭子标本H5亚型RT-PCR结果为阴性.结论:天津地区同时存在A(H1N1)、A(H3N2)和B型流感病毒,12月为发病高峰.天津市2004年发生禽流感时未发现人感染H5亚型禽流感病毒.
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2004-2005年流行性感冒流行季节河北省流感病毒监测结果分析
目的 了解河北省流行性感冒(流感)流行趋势及流感病毒的型别分布情况,为制定预防与控制流感流行措施提供科学依据.方法 依照<国家流感监测方案(试行)>要求的标准将2004-2005年流感流行季节的监测结果进行流行病学和病原学监测.结果 流感样病例门诊检出率为5.48%,其中儿童为7.84%,成人为0.96%;头采集流感样病例咽拭子标本769份,用MDCK细胞分离出流感病毒52株,分离率为6.67%,其中H3N2亚型38株,占73.08%,B型14株,占26.92%.结论 2004-2005年流感流行季节门诊流感样病例就诊高峰在1月份,儿童流感样病例的检出率较高,H3N2亚型流感病毒为流行优势毒株.
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呼吸道病毒基因反义技术的研究进展
反义寡核苷酸是一段与mRNA特异性结合并阻断其基因表达的人工合成的DNA分子,能通过封闭或抑制病毒的关键编码基因特异性地抑制病毒复制.本文以呼吸道合胞病毒和流感病毒为例,对呼吸道病毒特异性反义寡核苷酸的作用位点、序列设计、生物利用度(化学修饰、载体运用等)进行了讨论,以期为抗呼吸道病毒新型药物的研究提供一条新途径.
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流感病毒的病原学快速诊断
流感病毒可引起世界性的大流行,严重威胁着人类的健康.因此,建立一套早期、快速的检测方法就能进行有效的治疗.目前流感病毒的快速诊断主要包括病毒抗原检测、特异性基因片段检测及神经氨酸酶检测.本文从上述三个方面进行综述.
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16株甲型流感病毒耐药性基因测序结果分析
目的 调查吉林地区流感病毒流行株对金刚烷胺的耐药情况.方法 提取2005-2008年吉林地区流感流行季节分离的病毒流行株RNA,采用RT-PCR法扩增流感病毒的M2基因片断,检测病毒核酸测序并用生物信息软件分析与耐药性有关的氨基酸位点.结果 16株流感病毒全部对金刚烷胺类药耐药,耐药株变异表现为31位丝氨基酸被天冬酰胺置换.结论 金刚烷胺类药已不适用于流行性感冒的治疗,应进一步开展抗流感病毒耐药性的监测;同时应积极开展流感病毒对神经氨酸酶抑制剂类药物的监测.
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上海和无锡流感病毒病原学监测及血凝素基因变异
目的 了解2004至2006年流感流行季节流感病毒型及亚型在上海及无锡两地流感样患者中流行情况及病毒型内血凝素(HA)基因变异状况.方法 与上海及无锡市疾病预防控制中心合作,对门诊流感样患者及集体单位聚集性流感样暴发患者采集鼻咽拭标本,接种MDCK细胞,分离流感病毒,直接荧光免疫法鉴定阳性分离株型别,对甲型流感病毒采用RT PCR鉴定亚型,并对部分H3、H1亚型流感病毒进行HA全基因片段测序,分析流感病毒HA基因变异状况.结果 2004年8月至2006年9月,上海及无锡两地流感样患者中共分离到126株流感病毒,其中53株为H3N2亚型,43株为H1N1亚型,30株为B型.聚集性流感样疾病暴发多在2、3月份,分析7起聚集性流感样疾病暴发,分别为H3N2流感病毒感染2起,H1N1流感病毒感染1起,B型2起,及H3N2、B和H1N1、B混合感染各1起.HA序列分析,HI、H3与同期其他国家和地区的分离株近源.结论 上海及无锡两地散发和局部暴发的甲型流感病毒感染仍主要为H1N1、H3N2亚型,未发现HA、NA重组株和新的HA、NA亚型;1～3月份为发病高峰;H1、H3型内变异状况与其他国家和地区相似.
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变异的非结构蛋白对干扰素调节因子3的作用
目的研究一种变异的流感病毒非结构蛋白(NS1)对干扰素调节因子3(IRF-3)抑制作用的影响.方法用A/FM/1/47、A/HK/1/68、A/HK/1/68-MA20、A/HK/1/68-MA20C和阳性对照Sendai病毒(SV)感染HEK293细胞,Western blot比较这些病毒感染后磷酸化的迁移较慢的IRF-3Ⅲ和Ⅳ型是否出现.亚克隆A/HK/1/68的野生型NS1和A/HK/1/68-MA20的变异型NS1至pcDNA3.1-flag构建flag-NS1野生型,flag-NS1变异型质粒,分别用两种质粒转染HEK293细胞,转染后16 h,感染SV 8 h,然后收集细胞,作Western印迹分析,用抗flag抗体鉴定野生型和变异型NS1的表达,用抗IRF-3抗体观测NS1对SV活化IRF-3的抑制作用,用荧光素酶功能分析的方法观测两种NS1对SV诱导的干扰素β启动子-pGL-2B荧光素酶活性的影响.结果感染的5种病毒中仅毒性较低的A/HK/1/68-MA20和阳性对照SV能使IRF-3磷酸化,感染MA20后9 h开始有IRF-3磷酸化,23 h和26 h强,比较A/HK/1/68和A/HK/1/68-MA20的NS1序列,发现从cDNA起始的第94位核苷酸由T变成C,蛋白质的第23位由缬氨酸变成丙氨酸.NS1野生型和变异型均有高表达.结论 A/HK/1/68-MA20的NS1的点变异可导致失去野生型NS1的抑制干扰素β启动子活性的作用.
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宁波市甲3型流感的流行与基因演变连续7年监测分析
目的 了解甲3型流感病毒的抗原变异与流感流行的关系.方法 用狗肾传代细胞(MDCK)分离流感病毒,逆转录.聚含酶链反应(RT-PCR)扩增血凝素基因产物,纯化后进行核苷酸序列测定.结果 2002～2008年,宁波市流感流行有春季和夏秋季两个季节性高峰,而病毒抗原性突变大多发生在夏秋季这一季节.2002～2005年在血凝素基凶HAI片断的变异较快,且第225～228位之间的氨基酸每年都有突变:而2005～2008年间这一区域却相当稳定.结论 同一亚型的流感病毒在此春季刚流行后紧接着夏秋季再次引起流行这可能与病毒的变异多数发生在每年的下半年有一定联系.甲3型流感2002～2005年的流行强度较2005～2008年强,可能与前者的血凝素基因HA1片断第225～228位每年都发生改变而后者却相当稳定有关.
