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云南省边境地区禽流感H5N1亚型病毒基质蛋白2基因进化分析
目的 了解2008-2012年云南省边境地区禽流感H5NI亚型病毒基质蛋白2(M2)和离子通道蛋白基因变异特征及遗传进化关系.方法 于2008-2012年采集云南省边境地区(越南、老挝、缅甸与云南省交界处)家禽和野生鸟类棉拭子样品1240份,经H5N1亚型特异性多重RT-PCR检测,对阳性样品病毒M基因进行扩增,克隆至pMD18-T载体测序,获得M2基因序列,并与已知参考毒株序列进行序列比对及系统发育分析.结果 自1240份样品中检出H5N1亚型阳性样品71份,阳性率为5.72％；选择其中的30份阳性样品进行病毒M2基因测序,共获得14种不同序列,存在3个不同进化分支:1.2.1、1.2.2、2,各有5、7、2份.通过基因系统发育分析发现,M2基因与HA基因呈现不同进化关系；M2蛋白涉及表位、金刚烷胺抗性和禽源、人源毒株的关键性氨基酸位点存在替代或突变.结论 2008-2012年期间云南边境H5N1亚型病毒M2基因具有遗传差异,M2基因进化分支1.2.2毒株已成为当地流行的优势毒株.
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EB病毒感染及30 bp缺失潜伏膜蛋白1基因在鼻咽部癌不同组织学类型中的比较
目的比较鼻咽部癌4种组织学类型中EB病毒的感染率以及野生型潜伏膜蛋白(LMP)1和缺失型LMP1 EB病毒变异株单独或双重感染的检出频率, 阐明缺失型LMP1基因在鼻咽癌变过程中的作用.方法采用EBER原位杂交法检测117例鼻咽部癌,包括48例非角化性癌、25例角化性鳞状细胞癌、5例腺鳞癌、6例黏液表皮样癌和33例腺癌标本.采用巢式聚合酶链反应(PCR)法检测99例EBER阳性的癌组织和53个健康成人的外周血单个核细胞EB病毒LMP1基因.结果 EBER原位杂交示, 48例非角化性癌和25例角化性鳞状细胞癌的EB病毒感染率均为100%; 而腺鳞癌和黏液表皮样癌的EB病毒感染率为9/11,腺癌为51.5% (17/33).阳性病例中大多数非角化性癌细胞呈EBER阳性, 而在17例腺癌中仅见到少数EBER阳性肿瘤细胞.在非角化性癌中检测到单独缺失型LMP1 EB病毒变异株的百分率(85.4%,41/48) 不但高于健康成人外周血单个核细胞(8.7%,4/46), 而且高于角化性鳞状细胞癌(16.0%,4/25).在角化性鳞状细胞癌中检出野生型LMP1和缺失型LMP1基因EB病毒的双重感染率(56.0%,14/25) 高于非角化性癌的(12.5%,6/48).在腺癌和健康成人单个核细胞中检出的大多数EB病毒为野生型LMP1和缺失型LMP1基因变异株同时并存.非角化性癌/角化性鳞状细胞癌、腺鳞癌/黏液表皮样癌和腺癌之间的EB病毒感染率差异有显著性意义.非角化性癌和角化性鳞状细胞癌EB病毒的感染率相同, 但非角化性癌中单独缺失型LMP1 EB病毒变异株检出率远远大于角化性鳞状细胞癌, 角化性鳞状细胞癌多数含有野生型LMP1和缺失型LMP1双重EB病毒变异株.结论由于分化导向不同而发生的鼻咽部癌不同组织学类型具有不同的EB病毒感染率.缺失型LMP1基因的EB病毒变异株可能在非角化性癌中呈选择性优势.
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鼻咽癌中EB病毒BamHI"f"变异和潜伏膜蛋白1基因XhoI缺失型的分析
目的检测鼻咽癌组织中EB病毒 BamHI"f"和LMP1 XhoI-loss基因变异并探讨其意义.方法采用聚合酶链反应(PCR)、巢式PCR和限制性酶切分析检测40例鼻咽癌组织中EB病毒 BamHI"f"和LMP1 XhoI-loss基因变异.对48例健康成人外周血单个核细胞进行了EB病毒LMP1 XhoI-loss变异的检测.对3例具有代表性的PCR产物进行了基因序列分析.结果 40例鼻咽癌中EB病毒BamHI"f"变异型30例(75%),BamHI F型10例(25%).40例鼻咽癌组织中39例同时进行了EB病毒LMP1 XhoI-loss的检测,30例(76.9%)为LMP1 XhoI-loss;7例(18.0%)为LMP1 Wt-XhoI;2例为LMP1 Wt-XhoI和XhoI-loss并存.97.4%(38/39)鼻咽癌中至少出现一种类型EB病毒基因变异.仅1例鼻咽癌为EB病毒LMP1 Wt-XhoI/BamHI F,基因序列分析(LMP1第3外显子)发现也有7个碱基替换(其中5个为错义突变和2个为同义突变).48例健康成人外周血单个核细胞有10例(20.8%,10/48)成功扩增出EB病毒LMP1片段,10例均为LMP1 Wt-XhoI.结论与B95-8细胞株中EB病毒基因比较,鼻咽癌组织中EB病毒几乎均存在基因变异.健康成人携带的均为EB病毒LMP1 Wt-XhoI,而鼻咽癌细胞中主要为LMP1 XhoI-loss.因而,EB病毒基因变异可能与鼻咽癌的发生发展过程有关.
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西尼罗病毒E蛋白结构域Ⅲ特异性单克隆抗体的研制
目的 研制针对西尼罗Ⅲ重组融合蛋白的特异性单克隆抗体.方法 用西尼罗Ⅲ重组融合蛋白免疫BALB/c小鼠,用淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,并用间接ELISA方法进行筛选,所获得的单抗经间接ELISA、免疫印迹和间接免疫荧光试验进行鉴定.结果 共获得了3株能稳定分泌针对西尼罗河病毒E蛋白结构域Ⅲ的特异性单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为4F7、6H3和8E4,其单抗亚类鉴定分别属于IgG1、IgG1和Ig2a.这3株单克隆抗体均能与重组西尼罗河病毒E蛋白结构域Ⅲ发生特异性反应,而与日本脑炎病毒无交叉反应,并且,8E4和6H3识别同一抗原位点,4F7识别西尼罗河病毒E蛋白结构域Ⅲ的另一抗原位点.结论 本实验成功研制出针对西尼罗河病毒E蛋白结构域Ⅲ的特异性单克隆抗体,为我国建立西尼罗河病毒的病原学检测方法并与日本脑炎病毒进行鉴别诊断提供了技术贮备.
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人巨细胞病毒pp65原核表达载体构建及表达产物对特异性免疫应答的诱导
目的构建人巨细胞病毒pp65原核表达载体,研究纯化后的重组pp65蛋白诱导特异性免疫应答的作用及其特异性. 方法采用体外DNA重组技术,构建pp65原核表达载体并诱导其表达,通过亲和层析对表达产物进行纯化和经Westen blot鉴定;用MTT法检测重组蛋白对人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的激活、增殖作用,检测激活淋巴细胞对受HCMV感染的人胚肺成纤维细胞(human embryo lung fibroblast, HEL)的杀伤作用. 结果成功构建pp65原核表达载体并诱导其高效表达,纯化后的pp65蛋白能促进PBMC激活和增殖,增殖的细胞可特异性地杀伤受HCMV感染的HEL细胞. 结论经重组pp65蛋白激活增殖的淋巴细胞,可特异性杀伤受HCMV感染细胞,对HCMV感染的免疫治疗具有十分重要的作用.
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韩国淋巴瘤与中国延边地区淋巴瘤和鼻咽癌中EB病毒类型和30bp缺失型潜伏膜蛋白-1基因表达的比较研究
目的比较韩国淋巴瘤与中国延边地区淋巴瘤和鼻咽癌中EB病毒类型的分布特点.方法采用聚合酶链反应(PCR),巢式PCR,限制性酶切分析和Southern印迹杂交技术检测EB病毒的类型分布.结果在韩国非霍奇金淋巴瘤中,57%的B细胞淋巴瘤和75%的T细胞淋巴瘤表现为EBNA-1阳性."C"变异型为44%,"f"变异型为9%.而在15例霍奇金淋巴瘤中,4例为"CF"变异型,11例为"DF"型.在延边地区,22%的淋巴瘤和81%的鼻咽癌表现为EBNA-1阳性.除1例"f"变异型以外,均为"F"型,"C"变异型占鼻咽癌的63%.此外,30bp缺失型潜伏膜蛋白-1基因在韩国淋巴瘤病例中占80%,未缺失型占14%,两者兼有者占6%.而在延边地区,缺失型在淋巴瘤中仅占43%,在鼻咽癌中占40%.结论EB病毒-1型为韩国和延边地区的主要EB病毒株.BamHI"f"变异型在两地区均罕见.但在韩国淋巴瘤病例中,30bp缺失型LMP-1基因的检出率则明显高于我国延边地区.
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2009年新型甲型H1N1流感病毒基质蛋白基因进化的新探讨
目的 探讨甲型H1N1流感病毒基质蛋白(M)基因的进化规律及M2蛋白的氨基酸替代情况.方法 从NCBI数据库下载甲型H1N1病毒M基因179条进行预分析,终选取50条采用MEGA 4.0软件对其进行比对,采用NJ法构建进化树,同时采用MEGA 4.0软件对M2蛋白氨基酸序列进行比对.结果 不同地区新型甲型H1NI流感病毒M基因同源性高,达99.6%～100.0%,但与历史上流行的H1N1和H3N2流感病毒M基因差异较大,仅与1999-2002年间香港地区流行的H3N2亚型猪流感病毒同源性较近,为96.7%~97.7%.2009年流行的新型甲型H1N1流感病毒与历年来流行的H1N1人流感病毒相比,在第11、13、14、16、20、28、31、43、54、57、77、78、82、86、89、93位氨基酸位点发生了变异;与历年来流行的H1N1禽流感病毒相比,在第13、14、16、31、43、55、77、89位氨基酸位点发生了变异;与H1N1猪流感病毒相比,在第13、14、19、43、55位氨基酸位点发生了变异.2009年流行的甲型H1N1流感病毒与历年来流行的H3N2人流感病毒相比,在第11、13、16、20、28、31、43、54、57、77、78、82、86、89、93位氨基酸位点发生了变异;与历年来在欧亚大陆流行的猪流感病毒相比,所比较的19个位点均有部分毒株发生变异;而与1999-2002年间在香港流行的H3N2猪流感病毒相比,仅在第13、14、21、43位氨基酸位点发生变异.结论 此次新型甲型H1N1流感病毒M基因可能由香港地区流行的H3N2猪流感病毒重组而来.M2蛋白胞外编码区氨基酸位点发生变异,提示在疫苗研制方面应注意由此带来的影响.跨膜区的突变可能是导致此次新型甲型H1N1流感病毒对金刚烷胺类特异性抗病毒药物产生耐药性的原因,第43位氨基酸位点可能为引起此次耐药的主要位点.
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强直性脊柱炎并发虹睫炎易感性与LMP2和LMP7基因多态性的探讨
目的 研究LMP基因多态性与强直性脊柱炎并发虹睫炎发病的关系.方法 应用PCR对正常人和病人进行HLA-B27检测以及LMP2和LMP7扩增.CfoI进行限制性酶切图谱分析.结果 强直性脊柱炎有虹睫炎(AS+AAU)病史以及单纯虹睫炎(AAU)患者LMP2基因BB纯合型较正常人以及强直性脊柱炎(AS)患者明显增高(P＜0.05).AS+AAU患者BB型OR＝3.6,AAU患者BB型OR＝5.83.LMP7基因多态性无明显差别.结论 在我国汉人中,LMP2基因多态性与AS+AAU以及AAU发病存在明显相关关系.
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基于基质蛋白2的通用流感疫苗研究现状
疫苗是预防流感为有效的方式.由于流感病毒存在抗原漂移和抗原转换的特性,使得现有疫苗不能很好应对未知的季节性流感以及新发流感大流行,因而研发一种能够对多个亚型流感病毒提供交叉保护的通用疫苗具有重要意义.流感病毒基质蛋白2(matrix protein 2,M2),尤其是其胞外区,在甲型流感病毒的所有亚型中几乎是完全保守的,是很有前途的候选抗原,可以发展成为广谱重组流感疫苗.针对M2设计的流感疫苗临床前以及部分临床试验已经证明其可以保护动物抵抗同源和异亚型甲型流感病毒的攻击.
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鼻咽癌组织端粒酶催化亚单位与LMP1的表达及其相关性研究
目的研究EB病毒潜伏膜蛋白(LMP1)和人端粒酶催化亚单位(端粒酶逆转录酶hTERT)在鼻咽癌组织中的表达,探讨鼻咽癌中hTERT与EB-LMP1之间的相关性.方法应用免疫组化技术检测64例鼻咽癌组织中hTERT与EBV-LMP1的表达,统计、分析hTERT与EB-LMP1之间的相关性.结果鼻咽癌组织hTERT的阳性率为78.1%(50/64),LMP1阳性率为67.2%(43/64);50例hTERT阳性标本中,有39例LMP1阳性,二者均阳性的百分率为78.0%(39/50),14例hTERT阴性标本中,10例LMP1阴性,二者均阴性的百分率为71.4%(10/14),二者之间高度相关(χ2＝9.98,P＜0.01).结论鼻咽癌中,EV病毒潜伏膜蛋白与端粒酶催化亚单位的表达高度相关.
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SARS冠状病毒M蛋白基因的克隆、鉴定及原核表达载体的构建
目的通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增SARS冠状病毒M蛋白基因,并构建M蛋白基因的原核表达载体,为进一步研究其功能做准备.方法提取SARS冠状病毒总RNA,通过RT-PCR对其M蛋白基因进行扩增,并构建M蛋白基因的原核表达载体.结果获得了SARS冠状病毒M蛋白基因的编码序列并将其克隆入原核表达载体pET30a.结论成功构建SARS冠状病毒M蛋白基因的重组表达质粒,为进一步研究打下基础.
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经典性霍奇金淋巴瘤中EB病毒潜伏膜蛋白1的表达
目的探讨经典性霍奇金淋巴瘤(cHL)肿瘤性H/R-S细胞埃泼斯坦-巴尔病毒(EBV)潜伏膜蛋白1(LMP1)的表达情况及其意义.方法采用免疫组化SABC法对32例cHL进行LMP1蛋白表达的检测.结果 20/32(62.5%)例LMP1蛋白表达阳性,在各亚型之间没有显著性差异(x2=0.809,p=0.847).结论 LMP1蛋白表达有地区差异,在cHL亚型间可能没有分型差异性.
