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幽门螺杆菌外膜蛋白GroEL优势T-B联合抗原表位的鉴定
目的 筛选并鉴定幽门螺杆菌外膜蛋白GroEL的优势T细胞和B细胞(T-B)联合抗原表位.方法 采用PCR扩增幽门螺杆菌NCTC11637株groEL基因并构建其原核表达系统,SDS-PAGE检查目的重组蛋白rGroEL表达情况.Ni-NTA亲和层析法提纯rGroEL.采用激光共聚焦显微镜法检测幽门螺杆菌NCTC 11637和SS1株中GroEL分布.Triton X-114法提取上述菌株外膜蛋白样本,采用Western blot法检测外膜蛋白样本中的GroEL.采用专业生物信息学软件预测GroEL的T-B联合抗原表位并构建其噬菌体展示系统.采用Western blot法和ELISA分别检测含T-B联合表位肽的重组噬菌体PⅢ蛋白和人工合成的T-B联合表位肽的免疫反应性.结果 幽门螺杆菌NCTC11637和SS1株groEL基因核苷酸和氨基酸序列相似性高达97.68％～99.63％.所构建原核表达系统能有效表达可溶性rGroEL.GroEL定位于幽门螺杆菌NCTC11637和SS1株外膜.GroEL168、GroEL258、GroEL288、GroEL365、GroEL396和GroEL438六个主要的预测T-B联合抗原表位中,GroEL168显示了很强的阳性杂交信号.ELISA结果显示,GroEL168免疫反应性强(P＜0.01),其次为GroEL258和GroEL288 (P＜0.05).结论 GroEL是幽门螺杆菌外膜蛋白.GroEL168是GroEL的优势T-B联合抗原表位,可用于制备幽门螺杆菌多抗原肽疫苗.
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幽门螺杆菌GroEL基因真核表达载体构建及鉴定
目的 构建幽门螺杆菌热休克蛋白GroEL基因的真核表达载体pcDNA3.0-GroEL,为幽门螺杆菌的基因疫苗研制提供参考依据.方法 提取幽门螺杆菌基因组DNA,PCR扩增GroEL基因,克隆至pMD19-T载体,通过PCR、酶切及测序鉴定后,将GroEL基因片段用限制性内切酶切下,克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建pcDNA3.0-GroEL重组质粒；采用PCR、酶切对重组质粒pcDNA3.0-GroEL进行鉴定.结果 扩增出幽门螺杆菌GroEL基因片段约1 640 bp; pcDNA3.0-GroEL重组质粒经Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切,产生1个与GroEL基因PCR产物大小一致的小片段和1个不同于pcDNA3.0-GroEL重组质粒的大片段,表明GroEL基因已成功插入pcDNA3.0质粒中.结论 成功构建幽门螺杆菌GroEL基因真核表达载体pcDNA3.0-GroEL.
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结核分枝杆菌GroEL基因的克隆及真核表达质粒的构建
目的 克隆结核分枝杆菌基因组携带的两组GroEL基因,即GroEL1和GroEL2,它们分别编码热休克蛋白HSP60(cpn60.1)和HSP65(cpn60.2),并构建真核表达质粒.方法 用带有EcoR I和Xba I酶切位点的特异性引物,从结核杆菌H37Rv株中PCR扩增两组GroEL基因,构建重组真核表达质粒pCDNA3.1-GroEL1和pCDNA3.1-GroEL2,并进行酶切和测序鉴定.结果 成功克隆了结核分枝杆菌两组GroEL基因,酶切鉴定pCDNA3.1-GroEL1和pCDNA3.1-GroEL2构建成功,经DNA测序证实,载体上插入的序列与GenBank公布的序列一致.结论 获得了结核分枝杆菌GroEL1和GroEL2基因,成功地构建了含GroEL1和GroEL2基因的真核表达质粒,为研究其作为核酸疫苗在免疫学方面作用提供材料.
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玉米蚜体内参与传毒的共生菌groEL基因的克隆和原核表达
以玉米蚜杨凌生物型为材料,设计特异性引物采用PCR的方法在国内首先克隆了一种玉米蚜体内参与传毒的共生菌groEL基因,序列测定结果表明:玉米蚜杨凌生物型共生菌groEL墓因全长为1647bp,编码548个氨基酸,登录Genebank,序列号为AF387863.构建了该基因的原核表达载体,用pBV221表达出63KDa的非融合目的蛋白,用pET-30a表达出69KDa的融合蛋白,二者均有较高的表达量.
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不同pH条件下高低致龋性变异链球菌sRNA SpR19及其潜在靶标GroEL的表达变化
目的 研究在不同pH培养条件下,变异链球菌菌株的sRNA SpR19及其潜在靶向的GroEL蛋白在不同致龋力菌株中的表达变化,探讨其作为高致龋变异链球菌的分子鉴别标志物的可能性.方法 提取高致龋性变异链球菌的临床分离株(菌株17)和低致龋性变异链球菌的临床分离株(菌株5)的总RNA,建库后进行高通量测序获得差异表达的sRNA;结合生物信息学与文献,挑选关键sRNA与蛋白进行不同致龋菌株表达水平的研究:qRT-PCR验证目的sRNA SpR19在pH5.5和pH7培养条件下不同致龋能力菌株中的表达水平;合成变异链球菌GroEL蛋白抗原多肽并制备多克隆抗体,Western blotting鉴定不同pH培养条件下高、低致龋菌中GroEL的表达水平;qRT-PCR验证不同pH培养条件下不同致龋能力菌株GroEL的mRNA的表达水平.结果 生物信息学提示SpR19可能靶向GroEL的mRNA及上下游基因间区;不同pH条件下,相较于低致龋菌,高致龋菌中sRNA SpR19表达下降(P<0.05),而GroEL蛋白与mRNA高表达(P<0.05),二者表达趋势相反.结论 不同pH条件培养的高致龋性变异链球菌中,sRNA SpR19均低表达,GroEL的蛋白水平与RNA水平均存在高表达,结合生物信息学分析提示sRNA SpR19可能通过靶向GroEL负调控变异链球菌的致龋能力.
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沙门菌grOEL基因序列在系统发育分析和PCR-限制性片段多态性分析鉴定中的应用
目的 探讨grOEL基因序列在沙门菌进化分析和分型鉴定中的应用.方法 对8种血清群的沙门菌菌株进行PCR扩增、测序,然后用分子生物学软件Bioedit与DNAstar进行序列分析,同时用PCR.限制性片段多态性分析(RFLP)技术进行分型鉴定.结果 8种沙门菌血清群grOEL基因保守序列与变异序列呈锯齿状排列,其grOEL脱氨基酸系统发育树与grOEL基因系统发育树结果不完全相同,但O8、O9、O10之间亲缘关系近,PCR-RFLP分析有5种模式图.结论 grOEL基因序列在沙门菌系统发育中可作为遗传标记,同时也可作为分型鉴定的靶序列.
关键词： GroEL 系统发育 PCR-限制性片段多态性分析
