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电热培养箱温控系统小改动实现了大用处
今年我校医学院病理教研室进行一项DNA基因科研工作,需要使用热恒温培养箱设备.但需两种温度(92℃的DNA变性温度,72℃的DNA复性温度)超出了一般培养箱温度控制系统的控温范围.
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变性温度和时间对实时定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒的影响
背景:在实时荧光定量聚合酶链反应检测过程中,由于设计的热循环参数小同,检测结果常会出现假阳性或假阴性.目的:变件温度、变性时间以及聚合酶链反应运行的温度特性对实时荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒的影响.设计、时间及地点:对比观察实验,于2007-07-06/08在上海市安图医院PCR实验室完成.材料:LightCycler荧光聚合酶链反应检测仪山美国罗氏公司提供,乙型肝炎病毒核酸扩增聚合酶连反应荧光定量检测试剂盒由深圳匹基公可提供.方法:聚合酶链反应运行程序条什变性温度分别为88～97℃,变件时间分别为5 s和40 s,退火和延伸60℃,40 s,循环数40.主要观察指标:乙肝病毒遗传物质的数量.结果:聚合酶链反应运行温度上冲和下冲比较严重变性时间对DNA浓度较低的样本影响很大,DNA很难被检测出;变性温度超过95℃,变性时间超过40 s时,检测到的DNA的量明显降低;变性时间小于 20 s时,容易出现假阴性.结论:变性时间太短、变性温度太高且变性时间太长容易造成乙型肝炎病毒检测出假阴性.
关键词： 实时定量聚合酶链反应 乙型肝炎病毒 变性温度 变性时间 -
温和条件下分离马胶鲨皮胶原蛋白的方法及其部分特性研究
目的 探讨分离马胶鲨皮胶原蛋白的方法以及马胶鲨皮胶原蛋白的部分生物化学特性.方法 马胶鲨皮经清洗、浸泡、匀浆、离心得上清液.沉淀重复上述的提取过程,合并上清液,加硫酸铵沉淀胶原蛋白,回收的沉淀溶于磷酸盐缓冲液,经葡聚糖凝胶过滤后,蛋白溶出液被冷冻干燥.用聚丙烯酰胺凝胶电泳法、差示扫描量热仪法、圆二色谱仪法表征了通过上述磷酸盐缓冲液溶胀分离法获得的胶原蛋白的特性.结果 用磷酸盐缓冲液溶胀分离法从马胶鲨皮分离得到胶原蛋白,胶原蛋白的回收率为鲜重的3.2%～3.4%;分离的胶原蛋自在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈现清晰的三条谱带,分子质量分别为205 000、134 000、118 000;马胶鲨皮胶原蛋白的高热变性温度为47℃;分离的马胶鲨皮胶原蛋白在空间结构上以β-折叠为主,并包含有大量的无规卷曲.结论 本研究所制备的高纯度胶原蛋白可用于生物医学材料的进一步研究.
关键词： 马胶鲨皮 胶原蛋白 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 变性温度 二级结构 -
大马哈鱼皮胶原蛋白制备和表征
用稀碱处理大马哈鱼皮,然后进行限制性酶解,制备得到胶原蛋白,检验制备样品的纯度,测定样品的热变性温度和细胞相容性.制备的胶原蛋白α链的含量≥75%,β链的含量≤25%,有微量的γ链;变性温度是12.5C;细胞培养3天的相对活力是80.0±3.6%;大马哈鱼皮胶原蛋白为基质的细胞活力仅次于对照组(空白细胞培养板),优于聚乳酸、聚羟基丁酸和聚-3羟基丁酸戊酸.海鱼皮胶原蛋白可进一步应用于生物材料研究.
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用变性高效液相色谱检测CpG岛胞嘧啶甲基化
目的：建立一种新型的CpG岛胞嘧啶甲基化快速检测方法。方法：用亚硫酸氢钠处理DNA，再用链特异性聚合酶链式反应(PCR)对错配修复基因hMLH1启动子含CpG位点的靶序列进行扩增；利用变性高效液相色谱(DHPLC)在部分变性温度下测定靶序列的保留时间，并与亚硫酸氢钠-酶切法测定结果进行比较。结果：用DHPLC对结肠癌细胞株RKO和胃癌细胞株PACM82的hMLH1启动子进行测定，发现RKO细胞PCR产物的保留时间明显长于PACM82细胞(6.7 min比6.2 min)。RKO细胞PCR产物保留时间延长是亚硫酸氢钠处理后的模板中胞嘧啶和岛嘌呤含量较PACM82高所致。从此结果分析，可以判断出RKO的hMLH1启动子已甲基化，而PACM82细胞未甲基化。此结论与酶切法结果完全一致。结论：新方法可以快速检测CpG岛胞嘧啶甲基化。
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巴沙鱼皮胶原蛋白的提取、组成及变性温度研究
目的 从巴沙鱼皮中提取胶原蛋白并分析其结构类型及氨基酸组成,同时研究物理、化学交联法对其变性温度的影响.方法 采用酸提法和酶提法提取巴沙鱼皮中的胶原蛋白,并用SDS-PAGE凝胶电泳、FTIR和HPLC分析胶原蛋白的结构类型和氨基酸组成.通过测定黏度值研究物理、化学交联法对其变性温度的影响.结果 酸提法提取胶原蛋白的提取率为58.2％,酶提法的提取率为22.0％;巴沙鱼皮鱼胶原蛋白为Ⅰ型胶原蛋白;经120℃热交联后,巴沙鱼皮胶原蛋白的变性温度从34.2℃下降至28.0℃,经四甲基乙二胺(EDC)交联后,其变性温度上升至35.8℃.结论 巴沙鱼皮富含Ⅰ型胶原蛋白,酸提法比酶提法提取效率高,采用化学交联法可提高其变性温度,因而巴沙鱼皮可作为胶原蛋白的重要来源,可用于制备多种生物医用材料,具广泛的应用前景.
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不同鲨鱼皮胶原蛋白的分离及其特性研究
目的 探讨不同鲨鱼皮胶原蛋白的分离方法,并对分离胶原蛋白的部分生化特性进行研究.方法 用稀碱溶胀酶解法争缓冲液溶胀分离法分别从水鲨头皮和马鲛鲨皮中分离胶原蛋白,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)、差示扫描量热仪法(DSC)、园二色谱仪法(CD)对分离胶原蛋白进行纯度及分子大小、变性温度和二级结构的测定.结果 鲨鱼皮胶原蛋白回收率为鲜重的2.9%～4.1%;分离胶原蛋白在SDS-PAGE上呈现清晰的3条谱带,相对分子质量分别为205,134,118 KDa水鲨头皮和马鲛鲨皮胶原蛋白的热变性温度分别为69℃、47℃;两种分离胶原蛋白的二级结构均主要是β-折叠和无规卷曲,不存在α-螺旋.结论 采用稀碱溶胀酶解法和缓冲液溶胀分离法均能制备高纯度的胶原蛋白,从水鲨头皮和马鲛鲨皮分离的胶原蛋白相对分子质量争分子构成一致,但提取条件的不同能影响胶原蛋白的热变性温度和二级结构.
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定量PCR检测乙肝病毒DNA实验中变性温度和时间的影响
目的 探讨PCR仪温度特性及变性温度、变性时间对实时荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒的影响.方法 分析比较变性温度范围为88℃-97℃,变性时间分别为5 s和40 s,退火和延伸60℃,40 s,循环数40的实时荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒的效果.结果 变性温度超过97℃或者变性时间超过40 s.检测到的DNA的量明显降低;变性时间小于20 s,模板含量较低的样本难以检出.结论 变性初期或退火初期PCK温度与程序设置温度偏差较大;变性时间不应超过95℃,否则,检测到的DNA数量将显著降低;变性时间不应小于20 s或超过40 s,否则容易导致假阴性.
