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广西眼镜王蛇毒酸性磷脂酶A2-1的表达
将广西眼镜王蛇毒酸性磷脂酶A2-1(APLA2-1)基因克隆至表达载体pET28a(+),转化入大肠杆菌BL21,经过诱导,SDS-PAGE检测,重组质粒pET28a-APLA2-1在18KD有一明显的表达条带,表达产物APLA2-1约占细菌总量30%,并以包涵体的形式存在,将产物变复性后用Sephadex G-75 纯化,产物经过SDS-PAGE检测只有单一条带,通过Western-blot检测,证实纯化产物是酸性磷脂酶A2.对表达的APLA2进行酶活性和药理活性的测定.至此我们在大肠杆菌中表达了广西眼镜王蛇毒APLA2,这将为以后对PLA2的结构与功能的研究打下了良好的基础.
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广西眼镜王蛇毒杂合性酸性磷脂酶A2的基因克隆与序列分析
目的研究广西眼镜王蛇毒杂合性酸性磷脂酶A2(APLA2)的基因克隆与序列分析.方法从广西眼镜王蛇毒腺中提取总RNA,根据种属关系接近的台湾眼镜蛇毒APLA2两端非翻译区的保守序列设计引物,利用RT-PCR进行体外扩增,获得磷脂酶A2基因,克隆至pMD18-T载体,经测序筛选出APLA2-1,APLA2-2及一个新的酸性磷脂酶A2(命名为APLA2-3).根据测序结果确定了APLA2-3基因的全序列,并由此推导编码的氨基酸序列. 结果利用Antheprot 4.3c蛋白质序列分析软件包计算它的等电点为4.885,相对分子质量为16.543kD,并预测了它的二级结构和部分理化性质.同源性比较表明,APLA2-3的1～39位氨基酸残基序列与APLA2-2相同,其同源性为64%,而40～108位氨基酸残基序列与APLA2-1相同,其同源性为69%,109位氨基酸残基序列皆不同于这两种APLA2.结论 揭示了APLA2具有基因多样性,可能与物种进化和生物活性有关,并为进一步研究PLA2的结构与功能的关系提供更多的信息.
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卵黄抗体用于眼镜王蛇毒抗原检测的初步研究
眼镜王蛇属于眼镜蛇科、王蛇属,是世界上个体大的毒蛇,排毒量大,致死、致残高,早确诊早治疗是降低该类毒蛇咬伤、致死、致残的关键.在蛇伤诊断及蛇毒检测方面,国外主要采用ELISA,由于其使用的诊断试剂中的抗体来源于马等哺乳动物,而这些哺乳动物源性IgG类抗体易产生假阴性或假阳性结果,降低诊断的准确性.
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抗眼镜王蛇毒鸡卵黄抗体的研制及初步应用
目的研制抗眼镜王蛇毒鸡卵黄抗体,并研究该抗体在鸡卵黄中表达过程. 方法以甲醛减毒处理的眼镜王蛇粗毒免疫莱航母鸡,母鸡免疫应答后,在卵黄中产生抗眼镜王蛇毒抗体,应用嗜硫色谱柱HiTrap IgY Purification HP从鸡卵黄中提取抗眼镜王蛇毒抗体;以间接ELISA法及双向免疫扩散测定抗体的效价、特异性及免疫活性;采用Lowry氏法测定蛋白含量;采用SDS-PAGE法测定相对分子质量(Mr)及鉴定抗体纯度.结果母鸡初次免疫第9天即有抗体产生,初次免疫60 d后抗体效价超过1∶100 000,卵黄抗体经嗜硫色谱柱纯化后,经SDS-PAGE检测为电泳纯, 纯化后抗体效价较纯化前提高4倍,每枚蛋中平均可获得较纯抗体97.5mg.动物体外中和试验表明,特异性IgY能有效中和眼镜王蛇毒,阻止眼镜王蛇毒对小白鼠的攻击. 结论研制并鉴定了抗眼镜王蛇毒鸡卵黄抗体,分析抗体在产蛋期卵黄液中表达的进度,为今后该抗体的持续、高质量诱导奠定基础,同时也促进其他抗蛇毒鸡卵黄抗体的研究开发及蛇毒单克隆抗体的研制.
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卵黄抗体用于眼镜王蛇毒抗原检测的初步研究
目的探讨抗蛇毒卵黄抗体应用于蛇毒检测的可行性.方法以甲醛减毒的眼镜王蛇毒抗原免疫莱航母鸡,制备抗眼镜王蛇毒抗体;采用过碘酸钠法对特异卵黄抗体进行酶标; ELISA的实验条件及相关参数通过棋盘滴定法确定,并进行特异性、灵敏度、精确度及稳定性等测定.结果本检测方法的灵敏度可达32 μg·L-1,并且眼镜王蛇毒抗原浓度在32～750 μg·L-1的范围内,线性关系较好(r=0.963);卵黄抗体对眼镜王蛇毒具有较高的特异性,与蝰蛇科的五步蛇毒、园斑蝰蛇毒无交叉反应,与眼镜蛇科的金环及银环蛇毒仅在高剂量(剂量大于500 μg·L-1)时存在轻度交叉反应,但与眼镜蛇毒之间交叉反应明显.应用本方法对不同浓度(100、 300、 1 000 μg·L-1)的眼镜王蛇毒样品检测,结果平均板内相对标准差在1%～3%之内,板间相对标准差在8%以内;稳定性实验显示:卵黄抗体置于37 ℃条件6天,其检测结果与4 ℃条件下无显著差异 (P>0.05).结论特异的卵黄抗体应用于微量蛇毒检测研究是可行的,但仍需要进一步研究以降低交叉反应.
关键词： 眼镜王蛇毒 卵黄抗体(IgY) 母鸡 酶联免疫吸附测定(ELISA) -
眼镜王蛇抗蛇毒血清治疗蛇伤的研究
眼镜王蛇(ophiphagus hannah,Oh)排毒量大,毒性强,被其咬伤的患者发病急,病死率高达80%[1].在目前未有抗眼镜王蛇毒血清供临床使用的情况下,如何提高该蛇伤的治愈率,一直是蛇伤急救中的难题之一[2].本研究采用"抗眼镜蛇毒血清与抗银环蛇毒血清配伍"的方法治疗29例眼镜王蛇伤患者,并与同期单用抗眼镜蛇毒血清治疗的7例作对照,报告如下.
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抗眼镜王蛇毒卵黄抗体的免疫活性及其对眼镜王蛇毒的中和作用
目的:探讨抗眼镜王蛇毒卵黄抗体的免疫活性及其在体内外对眼镜王蛇毒的中和作用.方法:采用嗜硫色谱法一步分离纯化抗眼镜王蛇毒卵黄抗体,通过间接ELISA法对制备的抗眼镜王蛇毒卵黄抗体进行免疫活性检测,采用小鼠体内外保护实验评估抗眼镜王蛇毒卵黄抗体对眼镜王蛇毒的中和作用.结果:嗜硫色谱法制备的卵黄抗体具有良好的免疫活性,并且对眼镜王蛇毒素显示较好的中和效应,在体外 6 mg/kg 抗眼镜王蛇毒卵黄抗体可有效地中和约4 LD50(约 1.6 mg/kg)的眼镜王蛇毒素,而在体内可有效地中和约3LD50(约 1.2 mg/kg)的眼镜王蛇毒素.结论:抗眼镜王蛇毒卵黄抗体对眼镜王蛇毒具有良好的中和作用,本项目为抗眼镜王蛇毒卵黄抗体的进一步研究开发提供实验依据.
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卵黄抗体用于蛇毒抗原检测的初步研究
目的在常规ELISA检测中,以卵黄抗体取代哺乳动物来源的IgG类抗体,以探讨卵黄抗体应用于蛇毒检测的可行性.方法以甲醛减毒的眼镜王蛇毒抗原免疫莱航母鸡,制备抗眼镜王蛇毒抗体;采用过碘酸钠法对特异卵黄抗体进行酶标;将卵黄抗体及相应酶标抗体应用于常规ELISA中,对国内常见蛇毒样品抗原(包括眼镜王蛇毒、眼镜蛇毒、金环蛇毒、银环蛇毒、五步蛇毒及广东园斑蝰蛇毒)进行检测,并进行灵敏度、精确度、特异性及交叉反应等分析.结果检测的灵敏度可达32 μg·L-1,并且眼镜王蛇毒抗原浓度在32～750 μg·L-1的范围内,线性关系较好(r=0.963);初步应用表明卵黄抗体对眼镜王蛇毒具有较高的特异性,与蝰蛇科的五步蛇毒、园斑蝰蛇毒无交叉反应,与眼镜蛇科的金环及银环蛇毒仅在高剂量(剂量大于500 μg·L-1)时存在轻度交叉反应,不干扰实验检测,但与眼镜蛇毒之间交叉反应明显,干扰实验检测;应用本方法对低(100 μg·L-1)、中(300 μg·L-1)、高(1 000 μg·L-1)不同浓度的眼镜王蛇毒样品检测,结果平均板内变异系数均在1%～3%之内,板间变异系数在8%以内.结论 特异的卵黄抗体应用于微量蛇毒检测研究是可行的,具有灵敏度高、特异性较强等优点.该研究将为蛇伤诊断试剂盒的研制提供相应的理论依据.
关键词： 眼镜王蛇毒 卵黄抗体(IgY) 鸡 酶联免疫吸附试验(ELISA) -
抗眼镜王蛇毒鸡卵黄抗体的制备
目的研制抗眼镜王蛇毒鸡卵黄抗体,并研究该抗体在鸡卵黄中表达过程.方法以甲醛减毒处理的眼镜王蛇粗毒免疫莱航母鸡,母鸡免疫应答后,在卵黄中产生抗眼镜王蛇毒抗体,应用嗜硫色谱柱HiTrap IgY Purification HP从鸡卵黄中提取抗眼镜王蛇毒抗体;以间接ELISA法及双向免疫抗散法测定抗体的效价、特异性及免疫活性;采用福林酚法测定蛋白含量;采用SDS-PAGE法测定分子量及鉴定抗体纯度;抗体的特异性及交叉反应采用酶联免疫吸附法进行进行验证.结果母鸡初次免疫第9天即有抗体产生,初次免疫60天后抗体效价超过105;卵黄抗体经嗜硫色谱柱纯化后,经SDS-PAGE 检测为电泳纯, 纯化后抗体效价较纯化前提高4倍,每枚蛋中平均可获得较纯抗体97.5 mg ;所获取的抗体具有高度特异性,与蝰蛇科属的其它蛇毒无交叉反应,与眼镜蛇科蛇毒存在不同程度交叉反应(蛇毒浓度大于500 μg·L-1时明显).结论本研究首次研制并鉴定了抗眼镜王蛇毒鸡卵黄抗体,开拓了我国蛇伤治疗的新领域,并分析抗体在产蛋期卵黄液中表达的进度,为今后该抗体的持续、高质量诱导奠定基础,同时也促进其它抗蛇毒鸡卵黄抗体的研究开发及蛇毒单克隆抗体的研制.
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鸡卵黄抗眼镜王蛇毒抗体IgY的理化特性
目的研制抗眼镜王蛇毒鸡卵黄抗体并研究该抗体的理化特性.方法拟用减毒后的眼镜王蛇毒免疫母鸡后,从卵黄中制备抗眼镜王蛇毒抗体IgY.采用间接ELISA法对此抗体的理化特性进行研究.结果 ELISA显示免疫后12天开始出现特异性抗体,且抗体滴度逐渐升高,约在免疫后60天左右,高可达1:100000,此高滴度可维持30天,以后滴度逐渐降低,至免疫后100～110天.滴度仍可维持在高滴度的一半(1:50000).此抗体在10～65℃温度范围内活性保持稳定;在pH为4～12范围内,抗体活性稳定;此抗体经胰蛋白酶处理1h内,活性下降不明显,但1h以后活性迅速下降.结论从卵黄中制备抗眼镜王蛇毒抗体IgY,是可行的,稳定的.
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普通离子交换剂用于HPLC柱层析法快速分离眼镜王蛇毒
目的为了经济快速分离眼镜王蛇(Ophiophagus hannah,Oh)蛇毒中的毒素成分.方法用普通离子交换剂于高效液相色谱柱(HPLC)TSKgel SP-Toyopearl 650 SF(4×150mm)层析法,实验取得佳分离条件后,将蛇毒样品上柱后进行梯度洗脱,各洗脱峰收集后在Cosmosil 5C4-AR-300柱(4.6×150mm)上进行逆相HPLC分析.非单峰组分再进行HPLC凝胶过滤柱TSKgelToyopearl HW-40 Fine(4×250mm)层析,层析峰组分再进行HPLC逆相分析.结果眼镜王蛇毒经HPLC离子交换柱层析获得了16个蛋白组分,其中有5个组分经逆相HPLC分析单一组分;另外的复合性组分再进行HPLC凝胶过滤柱层析后又得到5个单峰蛋白组分. 结论HPLC离子交换柱层析对分离蛇毒蛋白很有实用价值,特别是蛇毒样品量少的情况下(10ug)也能较好分离.还具有分离时间短(1h左右),无须低温条件等优点.HPLC凝胶过滤柱层析可进一步使蛋白组分得到提纯.
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眼镜王蛇毒单克隆抗体的制备
目的:应用眼镜王蛇毒基因疫苗,免疫BALB/c小鼠,制备单克隆抗体(mAb).方法:应用眼镜王蛇Oh-3基因真核表达质粒pIRES-Oh3,佐以脂质体制成基因疫苗,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与同源Sp2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA筛选,有限稀释法克隆,制备mAb.结果:获得了2株分泌抗眼镜王蛇毒mAb的杂交瘤细胞株(F5、 F11),细胞培养上清液的抗体效价分别为3.2×10-1、 6.4×10-1,腹水抗体效价分别为1.28×10-4、 2.56×10-4.结论:成功地制备了2株眼镜王蛇毒mAb.
