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骨形态发生蛋白2基因转染人羊水干细胞复合β-磷酸三钙支架促进骨再生
目的 研究重组腺病毒介导的骨形态发生蛋白2(BMP-2)基因转染人羊水干细胞(hAFSC)的体外成骨分化,评价基因修饰的hAFSC负载于β-磷酸三钙(β-TCP)多孔支架后体内成骨能力.方法 收集人工破膜后的中段羊水原代培养hAFSC,免疫磁珠分选CD117/c-kit阳性的hAFSC,分别转染腺病毒介导的BMP-2或增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因,转染组转染BMP-2和EGFP基因、对照组转染无BMP-2编码序列的EGFP基因,空白组不做病毒转染.48 h后荧光显微镜下观察细胞荧光表达及生长状况,应用流式细胞仪检测转染率.转染第7、14、21、28天采用ELISA检测各组hAFSC培养液中的BMP-2分泌量以确认转染后目的蛋白表达效果.各组hAFSC成骨诱导14d后进行碱性磷酸酶(ALP)染色,28 d后进行茜素红染色评价成骨能力;成骨诱导3、7、14d后定量检测各组细胞ALP活性.20只8周龄裸小鼠随机分为Adv-hBMP-2-hAFSC-β-TCP组、Adv-EGFP-hAFSC-β-TCP组、hAFSC-β-TCP组和β-TCP组,每组5只,将细胞载体复合物植入各组裸小鼠股骨,8周后观察异位成骨组织学情况.结果 hAFSC生长良好,Adv-hBMP-2或Adv-EGFP基因转染48 h后荧光显微镜下见细胞贴壁良好,发出强绿色荧光,无死细胞产生,转染阳性率达(89.00±4.25)％.转染Adv-hBMP-2组hAFSC培养液上清中BMP-2第7、14、21、28天分别为(3.405±0.229)μg/L、(4.575±0.179)μg/L、(3.910±0.175)μg/L、(2.694±0.205)μg/L,第14天蛋白BMP-2分泌已达到高峰且第28天仍有蛋白表达,各时间点均明显高于对照组与空白组(均P＜ 0.05).hAFSC成骨诱导14d后细胞相连成片,与对照组及空白组比较,ALP染色转染组染色阳性面积更大、阳性细胞数量更多.成骨诱导28 d后茜素红染色见转染组细胞多中心聚集,伴大量红色钙结节形成,结节数量与大小明显优于对照组与空白组.成骨诱导3、7、14 d后各组ALP表达均升高,其中转染组ALP分泌逐渐增多,各时间点均高于空白组及对照组(均P＜0.05);对照组及空白组ALP分泌在成骨诱导3、7、14 d后均升高,各时间点ALP定量差异无统计学意义.体内植入8周后,Adv-hBMP-2-hAFSC-β-TCP组较其余3组材料降解更快,骨形成更多,未见纤维组织产生;Adv-EGFP-hAFSC-β-TCP和hAFSC-β-TCP组出现少量新生骨,材料降解较慢;β-TCP组单独植入后无明显降解,少量新生骨形成.结论 BMP-2基因转染的hAFSC有利于加强骨再生.
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胚胎创面无瘢痕修复的研究进展
胚胎创面无瘢痕修复是复杂的过程,除受到胚胎所处的羊水环境影响外,还受到胚胎细胞的端粒、细胞外成分、细胞因子等决定性因素的影响,羊水干细胞可能在胎儿无瘢痕修复过程中起到非常重要的作用.
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羊水干细胞对梗死心肌的修复作用
羊水干细胞(amniotic fluid stem cell,AFS)具有多向分化潜能,体外在一定的诱导条件下可以诱导AFS出现心肌表型,通过细胞移植为心肌梗死区域提供有功能的心肌细胞并改善心脏功能.已有资料表明AFS具有向心肌样细胞分化的能力,但AFS本身分化,具有功能性的心肌细胞能力较差,所以为了提高AFS分化为功能性心肌细胞的效率,以及能为临床应用是目前该领域的研究热点.本文就AFS对梗死心肌修复作用的研究进展进行综述.
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碱性成纤维细胞生长因子和Noggin诱导人羊水来源干细胞向神经细胞分化的差异比较
背景:相对于成体干细胞和胚胎干细胞自身存在的问题,羊水来源的干细胞系的建立,能为每一个个体建立一份自身的、具有高度增殖分化能力的干细胞储备,有望成为神经性退行性疾病细胞治疗的理想细胞来源.目的:观察Noggin和碱性成纤维细胞生长因子对人羊水来源干细胞向神经细胞分化的影响.方法:羊水标本来自怀孕16-22周行产前诊断的孕妇,在超声引导下行羊膜腔穿刺取得.利用CD117抗体,选用免疫磁珠法从人孕中期羊水标本中分离获得羊水干细胞,培养扩增后,通过流式细胞仪检测表面抗原表达进行鉴定.选取生长状态良好的第3代羊水干细胞,利用无血清的神经诱导培养液诱导其向神经细胞分化,分为空白对照组、基础诱导液组、Noggin诱导组和碱性成纤维细胞生长因子诱导组.倒置相差显微镜观察诱导后细胞形态的变化,细胞免疫荧光检测巢蛋白、β-Ⅲtubulin和神经丝蛋白在诱导后细胞中的表达.结果与结论:利用免疫磁珠方法分离出的羊水干细胞呈CD44和HLA-ABC表达阳性,CD45和HLA-DR表达阴性.诱导2周后,碱性成纤维细胞生长因子诱导组光镜下细胞形态发生显著变化,免疫荧光染色巢蛋白、β-Ⅲ tubulin和神经丝蛋白表达阳性率较高.Noggin诱导组细胞形态和染色结果与基础诱导液组无显著性差异.提示利用羊水来源的干细胞诱导分化为神经细胞的过程中碱性成纤维细胞生长因子的作用远优于Noggin.
关键词： 碱性成纤维细胞生长因子 羊水干细胞 神经细胞 诱导分化 -
羊水干细胞诱导肾移植免疫耐受及对氧化应激的影响
背景：干细胞在器官移植中诱导免疫耐受、延长移植物的存活时间、减轻排斥反应的作用已成为国内外众多学者研究的热点。目的：以供体羊水干细胞诱导异基因大鼠肾脏移植免疫耐受，探讨免疫耐受的形成机制。方法：分离培养Wistar大鼠羊水干细胞。选择雄性近交系Wistar大鼠和SD大鼠分别作为肾移植的供、受体，共分4组：假手术组(健康纯系雄性SD大鼠)、同系肾移植组(健康纯系雄性SD大鼠作供受体)、对照组(异系移植组加生理盐水)和实验组(异系移植组加羊水干细胞输注)。建立肾移植模型后，实验组由阴茎静脉缓慢推注3×109 L-1羊水干细胞1 mL，对照组则缓慢推注生理盐水1 mL。术后第5天检测血清中肌酐、尿素氮、白细胞介素2、干扰素γ水平及氧化应激指标，流式细胞术检测外周血CD4和CD8淋巴细胞百分比，观察移植肾的病理变化。结果与结论：实验组大鼠血清中尿素氮、肌酐、白细胞介素2、干扰素γ及氧化应激指标和尿蛋白定量、外周血淋巴细胞亚群CD4+，CD8+百分比及CD4+/CD8+比值显著低于对照组，而肌酐清除率则显著高于对照组，肾脏病理损害程度明显轻于对照组。结果显示羊水干细胞可以诱导大鼠肾移植免疫耐受，同时还可以抑制氧化应激水平，改善肾功能，减轻肾损害。
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CARM1维持羊水干细胞干性的机制
背景：研究表明，CARM1催化的组蛋白H3R17/R26的甲基化修饰对于胚胎干细胞干性的维持起着非常重要的作用，但其在羊水干细胞干性维持中的作用及机制目前尚不明确。
目的：初步探讨CARM1在维持羊水干细胞干性中的作用及其分子机制。
方法：分离、培养人妊娠晚期羊水干细胞，RT-PCR鉴定干细胞标志物及CARM1基因的表达。利用CARM1的两条shRNA慢病毒表达载体，沉默羊水干细胞中CARM1基因的表达。RT-qPCR检测CARM1基因的表达沉默效率，Western blot检测组蛋白H3R17的甲基化水平。RT-qPCR检测干细胞标志物OCT4，SOX2和NANOG基因的表达水平。
结果与结论：①人妊娠晚期羊水干细胞能够表达干细胞标志物，包括OCT4、SOX2、Nanog和KLF4，并表达CARM1基因；②CARM1的两条shRNA均能够有效沉默CARM1基因的表达；③CARM1表达沉默后，羊水干细胞中组蛋白H3R17的甲基化水平降低，OCT4和SOX2的表达也降低，而NANOG的表达没有发生变化；④结果表明，CARM1可能通过调控OCT4和SOX2基因的表达，进而起到维持羊水干细胞干性的作用。 -
羊水干细胞分泌细胞因子及其对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响
背景:关于细胞移植的功效,重点在于其分泌的促增殖或抗凋亡的细胞因子,羊水干细胞能否分泌相关细胞因子有必要深入分析.目的:观察分离培养的羊水于细胞分泌细胞因子情况,及其对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的作用.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-12/2009-06在南昌大学第一附属医院高血压病研究所完成.材料:10例剖宫产孕妇足月羊水,50 mL/例,用于分离培养羊水干细胞,同时留取其产后脐静脉用于分离培养内皮细胞,取前均获孕妇知情同意.方法:①贴壁法分离培养羊水干细胞,达80%融合时胰酶消化传代,取传至第3代细胞,调整细胞密度为5×10~8L~(-1),分为2组:缺氧羊水干细胞组通入体积分数为2%O_2+体积分数为5%CO_2+体积分数为93%N_2,常规羊水干细胞组通入体积分数为5%CO_2+体积分数为95%空气,两组细胞37℃培养24 h,收集各自培养上清液及细胞以备分析.②取体外分离培养的第2代人脐静脉内皮细胞,以2×10~4细胞/孔的密度接种于12孔板,分为3组:对照组加入含体积分数为5%胎牛血清的EBM-2新鲜培养液2 mL,常规羊水干细胞组加入含体积分数为5%胎牛血清的EBM-2新鲜培养液1 mL+羊水干细胞培养液1 mL,缺氧羊水干细胞组加入含体积分数为5%胎牛血清的EBM-2新鲜培养液1 mL+缺氧诱导羊水干细胞培养液1 mL,培养3d,加入10 μg/L肿瘤坏死因子α诱导细胞凋亡.主要观察指标:流式细胞仪测定羊水干细胞表面抗原表达,ELISA法测定羊水干细胞分泌血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子情况,RT-PCR法测定细胞因子mRNA的表达,检测内皮细胞增殖率及凋亡率.结果:培养7 d后羊水干细胞呈长梭形,以漩涡状、辐射状排列,第3代羊水干细胞呈CD29~+,CD105~+,CD34~-.常规培养的羊水干细胞可分泌血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子;缺氧诱导条件下血管内皮细胞生长因子水平明显增加(P＜0.01),其mRNA表达明显上调(P＜0.05),而肝细胞生长因子含量及mRNA的表达均无明显变化(P＞0.05).与对照组比较,培养3 d后常规羊水干细胞组、缺氧羊水干细胞组内皮细胞数均明显增加(P＜0.05),肿瘤坏死因子α诱导凋亡24 h后内皮细胞凋亡率均明显降低(P＜0.05),且缺氧羊水干细胞组变化幅度大于常规羊水干细胞组(P＜0.05).结论:羊水干细胞可分泌血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子,羊水干细胞培养液能促进内皮细胞增殖,抑制内皮细胞凋亡.经缺氧处理后,羊水干细胞分泌血管内皮细胞生长因子的能力增加,对内皮细胞的增殖和凋亡干预作用增强.
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羊水间充质干细胞的研究进展
近年来，通过对羊水进行体外细胞培养，研究增殖细胞的生物特性、诱导分化情况，证明了这种细胞具有多向分化的潜能，可以作为种子细胞用于临床方面的研究。其来源的易行性也为种子细胞的获得提供了方便。本文就羊水干细胞的研究现状进行了阐述，并讨论了研究的相关问题及应用前景。
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羊水干细胞治疗维甲酸诱导的大鼠骨质疏松的初步研究
目的:维甲酸( ratinoicacid)诱导雌性大鼠骨质疏松(Ostoporosis,op)模型,观察并分析羊水干细胞(amniotic fluid-derived stem cells,AFS)对OP的治疗作用.方法:选取40只SD雌性大鼠,随机分为4组,每组10只.除正常组(A组)外,模型组(B组),一次注入AFS组(C组)和两次注入AFS组(D组)均用维甲酸70mg/(kg-d)连续灌胃14d,A组用等量灭菌注射用水灌胃.于给药二,三周分别测量各组大鼠血清Ca、Pi、碱性磷酸酶ALP和抗酒石酸酸性磷酸酶TRACP含量,制造模型(简称造模)过程观察动物生活习性体重等变化,实验结束进行股骨骨形态计量学测量,骨薄片病理学观察.结果:造模过程中,大鼠出现少食,竖毛,及体重减轻.B.C组大鼠体重较正常组显著降低(P＜0.05).造模21d后,B组血清Ca2+水平显著升高.模型组骨密度较正常组显著下降(P＜0.05),但D组骨密度变化无明显统计学意义.B,C,D组血清ALP,TRACP均明显高于正常组(P＜0.05).骨薄片染色显示模型组骨胶原排列杂乱无序,结构松散,D组有修复迹象.结论:羊水干细胞尾静脉注射可缓解维甲酸诱导的大鼠骨质疏松,且两次次给药的治疗效果好于单次给药.
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人羊水干细胞系的建立及其生物学特性分析
建立体外稳定生长的人羊水干细胞(AFS)系并对其生物学特性作进一步鉴定.使用贴壁法分离培养羊水干细胞,通过扩增传代,建立体外稳定生长的人羊水干细胞系,采用RT-PCR检测干性基因的表达,流式细胞仪分析细胞表型,混合淋巴细胞培养检测对PBMC体外增殖的免疫调节作用并通过细胞计数研究其体外增殖潜能.成功建立三株体外稳定传代和生长的人羊水干细胞系,AFS表达干细胞特异性基因:Oct4、Sox2、Nanog、Klf-4、c-Myc和Rex-1;同时发现AFS高表达负性共刺激分子B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、BTLA和不表达HLA-DR、CD40、CD80和CD86,AFS可抑制PB-MC的体外增殖,不仅显示其具有低免疫原性,而且具有免疫调节作用.与此同时,AFS具有很高的体外增殖潜能.本研究建立的AFS系具有良好的干细胞生物学特性,可以作为一种来源充足的低免疫原性种子细胞用于组织工程的研究和应用.
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人羊水来源干细胞治疗大鼠卵巢早衰的初步研究
目的:尾静脉注射移植人羊水干细胞(AFS),评价其治疗大鼠卵巢早衰(POF)的效果.方法:采用SD大鼠,按体重随机分为四组:A组正常组、B组模型组、C组一次移植组和D组两次移植组,除A组灌胃生理盐水外,其余各组均连续14天灌胃雷公藤多苷片；C组在第14天灌胃后移植一次AFS,D组在第1天与第7天灌胃后移植两次AFS;观察大鼠阴道涂片、血清性激素水平、大鼠卵巢及子宫组织形态学变化.结果:(1)B组动情周期较A组显著延长,C组与D组均有不同程度恢复,D组恢复状况优于C组；(2)HE染色结果显示,D组大鼠卵巢均有新生卵泡；(3)性激素检测结果显示,各组之间E2值差异均有统计学意义(P均＜0.01).结论:AFS对POF有修复作用,可能通过促进卵泡生成,调节雌激素分泌,从而改善了卵巢功能.
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羊水干细胞移植对单侧输尿管梗阻小鼠肾脏微血管损伤的影响及其机制
目的 探讨羊水干细胞(AFSCs)移植对单侧输尿管梗阻(UUO)小鼠肾脏微血管损伤的影响及其可能的机制.方法 选择1例孕中期需进行产前筛查的孕妇,穿刺抽取羊水后分离、培养AFSCs,制备AFSCs悬液.将36只小鼠随机分为假手术组、模型组和观察组,每组12只.模型组和观察组采用结扎的方法建立左侧UUO模型,假手术组只游离输尿管不结扎.观察组腹部缝合后经尾静脉注射150 μL AFSCs悬液,模型组和假手术组注射等量生理盐水.三组术后第3、7天分别处死6只小鼠,采用HE染色观察肾组织病理情况,免疫组化法检测肾组织管周毛细血管密度,Western blotting法检测肾组织尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(gp91-phox)、抗硝基酪氨酸(NT)蛋白表达.结果 HE染色结果显示:假手术组肾脏结构正常;模型组术后第3、7天出现不同程度的肾小管上皮细胞肿胀,空泡变性,刷状缘消失,肾间质增宽,炎性细胞浸润,肾间质纤维化程度随时间延长而逐渐加重.观察组术后第3、7天均出现肾间质纤维化,但其程度均轻于模型组同时间点.模型组、观察组术后第3、7天肾组织管周毛细血管密度均低于假手术组同时间点,gp91-phox、NT蛋白相对比表达量均高于假手术组同时间点,但模型组变化更明显(P均＜0.05).结论 AFSCs移植可减轻单侧UUO小鼠肾脏微血管损伤;通过降低gp91-phox、NT表达而减轻氧化应激是其可能的机制.
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胚胎干细胞与羊水干细胞
目前干细胞的再生潜能得到生物医学领域诸多学者的关注,胚胎干细胞再生潜能高但获取有悖于伦理,科学家转而研究其他成体干细胞,以利用其再生特性进行器官修复等.该文就羊水干细胞与胚胎干细胞的特性、比较及应用予以介绍.
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羊水干细胞在再生医学的研究进展
目的 对羊水干细胞(amniotic fluid-derived stem cells,AFSCs)的研究进展及在再生医学等领域的发展进行综述,探讨今后AFSCs研究的相关问题. 方法 查阅近年来AFSCs的相关文献,对AFSCs在再生医学领域研究的成果及其基础与临床研究展望进行综述. 结果 目前研究已表明AFSCs具有多向分化潜能,在组织工程或细胞替代治疗的研究中展现出广阔的应用前景. 结论 羊水取材简便,对母婴创伤小,无致瘤性,无伦理学方面的限制,使AFSCs极有希望成为再生医学、抗肿瘤等领域中理想的种子细胞,具有广泛研究价值.
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羊水干细胞的研究进展
目的 综述羊水干细胞(amniotic fluid-derived stem cell, AFS)的研究进展及应用前景.方法 查阅近年来有关AFS的研究文献,对AFS的起源、培养方法、鉴定、定向分化进行综述,并对其应用前景进行分析.结果 1993年有研究提出AFS存在的可能性.在后续的研究中证实,AFS与其他干细胞一样存在一些表面标志物,并具有多分化潜能,在细胞治疗或组织工程研究中也有广阔的应用前景.结论 AFS作为一种新的干细胞,有进一步研究的价值.
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羊水干细胞体外培养早期和后期基因表达谱分析
目的 探讨羊水干细胞(amniotic fluid stem cells,AFSCs)体外培养早期和后期全基因组表达规律.方法 在公共基因芯片数据库GEO中找到羊水干细胞相关的基因芯片数据,使用R和Bioconductor软件包对其进行统计学分析,筛选差异表达基因,并进行GO分析和KEGG通路分析.结果 通过线性模型没有找到差异表达基因,而通过秩积法找到217个上调探针,278个下调探针.对这些差异表达基因进行功能富集,上调的生物过程是胶原纤维组织相关过程、细胞外基质组织、胞外结构组织、骨骼系统发育、细胞粘附等.下调过程显著的是核分裂过程,有丝分裂以及细胞周期相关过程.上调的通路为ECM受体交互通路和焦点粘附通路.下调通路分别是细胞周期,细胞因子受体交互通路,p53信号通路和卵母细胞减数分裂通路.结论 体外培养中AFSCs能很好地维持基因的表达.
