首页 > 文献资料
-
弓形虫P30与佐剂CTA2/B复合基因酵母表达载体的构建与生物信息学分析
目的构建含有弓形虫主要表面抗原P30与免疫佐剂CTA2/B 复合基因的克隆载体及酵母表达载体,为进一步真核表达重组P30-CTX 蛋白奠定基础. 方法 PCR 扩增P30-CTX 复合基因,产物回收后与pMD-18T 载体连接,转化大肠埃希菌DH5α,经氨苄抗性筛选及测序,建立克隆载体pMD18T-P30-CTX;克隆载体与表达载体双酶切后,回收1 313 bp 的P30-CTX 基因,亚克隆入酵母表达载体,转化大肠埃希菌DH5α,筛选、测序后建立酵母表达载体PGAPZαA-P30-CTX.重组质粒分别以PCR、酶切及测序鉴定.使用生物信息软件分析P30-CTX 复合基因,预测编码蛋白结构.结果重组质粒经PCR 可得1 313 bp 的特异条带,EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切获得1 313 bp和3 085 bp的条带,与预期大小一致,测序结果证实为pGAP-P30-CTX 基因,序列分析同源性为99.82%,P30-CTX蛋白结构折叠无明显改变. 结论成功构建了含有弓形虫主要表面抗原P30与免疫佐剂CTA2/B 复合基因的克隆载体及酵母表达载体,预测毕赤酵母表达系统对P30-CTX 的抗原性不会产生影响.
-
弓形虫P30基因—乳酸乳球菌重组质粒的构建及其表达
目的 构建表达弓形虫昆山分离株P30基因的乳酸乳球菌表达载体L2-Ps-P30-T,并在乳酸乳球菌中表达P30蛋白.方法 用BamH Ⅰ/Xho Ⅰ将P30从质粒pSK-P30中切出并克隆至质粒pSK-PsT,构建pSK-Ps-P30-T质粒；用PvuⅡ将表达元件-Ps-P30-T-从pSK-Ps-P30-T质粒中切出,以相同的酶切位点导入大肠埃希菌与乳酸乳球菌穿梭质粒pTRKL2,构建L2-Ps-P30-T质粒；通过电转化将L2-Ps-P30-T导入乳酸乳球菌中,以Western blot鉴定P30蛋白的表达.结果 酶切及PCR鉴定质粒L2-Ps-P30-T构建正确,并在乳酸乳球菌中表达能被弓形虫病患者血清识别的分子质量单位为30 ku的蛋白.结论 重组载体L2-Ps-P30-T构建正确,电转化入乳酸乳球菌后能表达具有反应原性的P30蛋白.
-
弓形虫昆山分离株P30蛋白的纯化、复性和鉴定
目的 表达并纯化弓形虫昆山分离株膜蛋白P30.方法 将构建的pET28b-P30重组质粒转入大肠埃希菌BL21,挑重组菌于LB培养基中增菌,IPTG诱导其表达,然后纯化包涵体,用尿素溶解包涵体,Ni2+ 螯合柱纯化产物,以透析法复性蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定.结果 大肠埃希菌表达的P30蛋白以包涵体的形式存在,P30蛋白经Ni2+ 螯合柱纯化后纯度大于95%.经Western blot鉴定,复性蛋白能被弓形虫感染的鼠血清识别.结论 得到了纯度高的膜蛋白P30.
-
如何解读病理报告——小世界大乾坤系列之(二)
上一期我们谈了何谓病理,了解了病理的重要性及病理科的工作程序,从而也知道了病理报告是如何生成的,这一期我们谈一下患者及家属关心的——如何解读病理报告.病理报告一般包括如下几个内容:1.报告名称:一般为“XX医院病理科病理学报告或细胞(病理)学报告”(P30图1).
-
芩白清肺浓缩丸对肺炎支原体作用
目的 观察芩百清肺浓缩丸(黄芩、百部、桔梗、地龙、麦冬、紫菀)对肺炎支原体ATCC 15531的作用.方法 肺炎支原体给予低剂量和高剂量的芩百清肺浓缩丸后,利用Real-time PCR、Reverse Transcription-PCR、WesternBlot方法测定肺炎支原体黏附蛋白P1、P30的表达.结果 与空白组比较,芩百清肺浓缩丸高剂量组和低剂量组都能下调P1、P30 mRNA和P1蛋白表达,但高剂量组作用更加显著.结论 芩百清肺浓缩丸通过降低P1、P30肺炎支原体蛋白的表达,从而妨碍肺炎支原体在呼吁道上皮细胞的定植达到抗肺炎的作用.
-
抗弓形虫P30单克隆抗体的制备及其抗虫作用观察
制备抗弓形虫天然P30、重组P30的单克隆抗体(mAb),并研究它们对虫体的影响,为弓形虫病诊断及保护性抗原鉴定奠定基础.采用弓形虫天然P30、重组P30及全虫抗原(对照)分别免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选稳定分泌高滴度mAb的杂交瘤细胞株.用ELISA法测定mAb亚类和效价;通过SDS PAGE和West-ern blot进行特异性鉴定;Giemsa染色观察杂交瘤细胞的染色体数目;利用扫描电镜及间接荧光抗体试验(IFAT)观察mAb对弓形虫的杀伤作用及其靶抗原定位.结果表明,筛选出2株(2B3、1H6)特异性较好、能稳定分泌mAb的杂交瘤细胞株.Western blot结果显示,2B3、1H6产生的mAb与弓形虫全抗原的阳性反应带均在30 000 Mr处;mAb亚类均属IgM,其效价(ELISA)分别为:2B3 1:102 400、1H6 1:51 200;2株细胞的染色体数均在100条以上.电镜观察与mAb作用后的弓形虫虫体聚集、肿胀,膜变厚,表面出现缺口和空洞,甚至虫体变形、破碎.抗弓形虫天然P30的mAb能识别重组体pET 30a-P30的表达蛋白.成功制备了抗弓形虫天然P30、重组P30的mAb,可进一步用于弓形虫病诊断及保护性抗原鉴定研究.
-
弓形虫P30基因重组质粒的构建及其免疫效果
目的通过构建含弓形虫玛0不同表达形式(膜型、分泌型及细胞内型)的重组质粒,并将其用于免疫小鼠,测定抗体水平,以期初步筛选出一种对弓形虫感染具有良好保护作用的核酸疫苗. 方法利用PCR技术和亚克隆技术分别构建弓形虫表膜型P30基因重组质粒(含完整的P30编码序列,包括信号肽及疏水尾)pcDNA3-P30Mb,分泌型P30基因重组质粒(含完整的P30编码序列,不包括疏水尾)pcDNA3-P30Se以及细胞内型P30基因重组质粒(含完整的P30编码序列,但不包括信号肽)pcDNA3-P30In.将以上3种重组质粒分别与脂质体混合后免疫小鼠,ELISA及免疫印迹测定小鼠血清中特异的IgG抗体.结果成功构建了弓形虫P30基因3种表达形式的重组质粒,经双酶切鉴定及DNA序列测定,3种重组质粒中的插入片段确为P0的编码基因,且读码框架正确;抗体测定显示:3个免疫组均能诱导小鼠产生特异的IgG抗体,但各组之间IgG出现的时间及强度有一定的差异.结论用编码弓形虫P30抗原的重组质粒进行核酸免疫,能诱导免疫小鼠产生特异性的IgG抗体;膜型及分泌型免疫小鼠的特异IgG抗体出现的时间早于细胞内型免疫鼠,但4 wk后3组间差异无显著性.
-
重组抗原金标免疫渗滤法检测弓形虫感染的研究
目的:建立一种快速、简便的弓形虫病诊断方法.方法:将弓形虫P30重组抗原包被于硝酸纤维膜上,以金标免疫渗滤法(DIGFA)检测兔血清中相应抗体,呈现红色斑点者为阳性.结果:检测弓形虫感染兔血清41份,阳性率为97.56%(40/41),检测正常兔血清20份,感染囊虫兔血清26份,感染血吸虫兔血清40份,感染丝虫兔血清21份,感染肺吸虫兔血清33份,仅2份血吸虫感染兔血清出现交叉反应.结论:弓形虫P30重组抗原金标免疫渗滤法检测弓形虫感染兔有较高的敏感性和特异性.
-
弓形虫主要表面抗原1核酸疫苗与蛋白疫苗联合免疫保护作用的研究
目的研究刚地弓形虫RH株主要表面抗原1(P30)DNA疫苗诱导BALB/c小鼠的保护性免疫作用.方法根据弓形虫P30基因的DNA序列设计一对引物,,将PCR扩增到的P30基因克隆到真核表达载体pcDNA.3.1中.大量制备pcDNA3.1-P30和pcDNA3.1质粒DNA.将48只BALB/c小鼠随机分成4组,每组12只,空质粒对照组(A组)第0、2、4周经小鼠股四头肌注射100 μg pcDNA3.1质粒DNA;重组P30抗原免疫组(B组)第0、2、4周每鼠经背部皮下多点注射50 μg rP30+福氏完全佐剂; P30 DNA疫苗免疫组(C组)第0、2、4周经小鼠股四头肌注射100 μg pcDNA3.1-P30质粒DNA;P30 DNA疫苗和重组P30抗原联合免疫组(D组)第0、2周经小鼠股四头肌注射100 μg pcDNA3.1-P30质粒DNA,第4周每鼠经背部皮下多点注射50 μg rP30+福氏完全佐剂.末次免疫4周后每鼠用100个弓形虫速殖子经腹腔感染,观察小鼠存活时间.结果成功构建刚地弓形虫RH株P30DNA疫苗,动物保护性实验表明,虽然与对照组相比实验组小鼠的存活时间有一定的延长,但差异无显著性.结论 pcDNA3.1-P30 DNA疫苗具有弓形虫病候选DNA疫苗分子的潜力.
-
刚地弓形虫P30两个不同片段的克隆、表达及鉴定
目的:构建刚地弓形虫(简称弓形虫)主要表面抗原P30基因的2个不同片段的克隆并进行表达、鉴定.方法:根据已发表的弓形虫P30基因序列,参考有关文献设计合成两对引物,用PCR从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出P30基因的两个不同片段,分别构建T-A克隆,经PCR扩增及酶切鉴定后,进行测序,再亚克隆入pMAL-p2质粒并转化DH5α感受态细胞,于氨苄青霉素LB平板上初步筛选阳性克隆,再经酶切及PCR扩增鉴定重组子.将重组子转入表达菌BL21,用IPTG进行诱导表达,并对所表达的蛋白以western blot鉴定.结果:成功构建相应的T-A克隆及pMAL-p2亚克隆,经诱导、表达和鉴定,证实2个表达产物均为目的蛋白,其分子量分别为70和73Ku.结论:成功获得弓形虫主要表面抗原P30的2个表达产物,为其进一步的纯化及应用奠定了基础.
-
重组质粒PcDNA3.1-P30-P22-CTXA2/B在Hela细胞中表达的研究
目的观察重组质粒pcD A3.1-P30-P22-CTXA2/B在Hela细胞中的表达情况,并检测其表达的融合蛋白P30-P22-CTXA 2/B免疫学活性.方法脂质体介导重组真核表达质粒pcDNA3.1-P30-P22-CTXA 2/B转染Hela细胞,G418筛选稳定转染的细胞株,收集蛋白行SDS-PAGE和Western-Blot分析,检测融合蛋白的免疫学活性.结果经重组质粒pcDNA3.1-P30-P22-CTXA2/B稳定转染的Hela细胞表达了分子量约64KD的融合蛋白,经Western-Blot检测证实该融合蛋白具有P30免疫原性.结论在HeLa细胞中成功表达了具有P30免疫原性的融合蛋白P30-P22-CTXA2/B,为下一步动物实验奠定了基础.
-
弓形虫表面抗原P30、P22与霍乱毒素A2/B复合基因真核表达质粒的构建
目的选择弓形虫RH株主要表面抗原P30、P22的有效基因片段和霍乱毒素A2/B亚基共同构建在同一真核表达载体pcDNA3.1(-)上,并保证其连接方向和开放读码框的正确.方法用PCR技术分别从弓形虫RH株基因组DNA和pUAB024-CTXA28/B质粒中扩增编码P30、P22基因片段和CTXA2/B,定向重组入pUC18克隆载体,然后酶切释放P30-P22-CTXA2/B复合基因片段,亚克隆入pcDNA3.1(-)真核表达载体,再经含氨苄青霉索的LB培养基筛选、酶切及测序鉴定.结果酶切产物经电泳显示条带清晰,P30、P22和CTXA2/B基因片段的泳动位置分别在786bp、492bp、512bp的位置,与预计结果一致;测序结果表明插入的基因片段方向及序列均正确.结论成功地构建了真核表达重组质粒pcDNA3.1-P30-P22-CTXA2/B,保证了三个基因连接方向,序列及开放读码框的正确,为下一步融合蛋白P30-P22-CTXAA/B在哺乳动物细胞中的表达及动物实验奠定了基础.
-
弓形虫复合抗原基因P30-ROP2在毕赤酵母中的表达、纯化与鉴定
目的构建含弓形虫主要表面抗原P30与致密颗粒蛋白ROP2复合基因重组质粒,并在毕赤酵母中表达、纯化与鉴定.方法用亚克隆技术把P30-ROP2复合基因克隆入表达载体,构建酵母表达载体pGAPZαA-P30-ROP2;线性化重组酵母表达载体,电穿孔法导入毕赤酵母GS115中,抗生素Zeocin筛选、PCR法鉴定阳性转化子;酵母工程菌大量摇瓶表达,纯化产物,免疫活性鉴定.结果获得pGAPZαA-P30-ROP2重组表达载体,SDS-PAGE和Western Blot结果显示P30-ROP2复合基因表达蛋白产物分子量约为66kD,具有一定的免疫活性.结论弓形虫复合抗原基因P30-ROP2在毕赤酵母中成功分泌表达,表达产物具有免疫活性,为弓形虫病诊断抗原及疫苗研制奠定基础.
-
弓形虫昆山分离株P30抗原基因的克隆与表达
目的在大肠杆菌中高效表达P30抗原.方法采用聚合酶链反应(PCR)从弓形虫昆山分离株cDNA文库中扩增得到编码P30抗原的基因,经DNA序列分析后导入表达载体pGEX-5x-3,然后在大肠杆菌BL21中进行表达,用亲和层析柱纯化表达产物,并以SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定.结果1、在我们比较的783个碱基中,弓形虫昆山分离株与RH株之间只有两个碱基不同;2、得到一分子量为54kDa的融合蛋白,占大肠杆菌总蛋白的38%.结论1、弓形虫昆山分离株与RH株的P30基因没有大的差异;2、在大肠杆菌中得到了P30融合蛋白的高效表达.
-
截短的弓形虫P30基因在E.cOli中的高效表达及纯化条件的探索
目的构建能在E.coli中高效表达的弓形虫主要表面抗原(P30)基因的重组表达质粒，并对纯化条件进行优化。方法 对已知的弓形虫P30基因序列进行部分取舍，用PCR技术从弓形虫ZS1株的基因组DNA中扩增出截短的P30基因片段，插入载体pET-30(a)中，转化大肠杆菌DH5 α，IPTG诱导表达，包涵体经洗涤、变性、复性及不同程度的浓缩后，进行SDSPAGE及免疫印迹分析。结果从弓形虫ZS1株基因组DNA中扩增出截短的P30基因片段，成功构建重组表达质粒pETP30；SDS-PAGE显示蛋白表达带的分子量约为31kD，表达量占菌体总蛋白的31.58％，经1M及2M尿素洗涤后，其纯度分别达63.42％及75.74％；免疫印迹显示，该纯化蛋白能被弓形虫病人阳性血清所识别，而且当浓缩至初始体积的1/3～1/6时，纯化蛋白与DNA免疫鼠血清的反应强。结论成功构建重组质粒pET-P30，并以融合蛋白的形式进行了高效表达，经变性、复性后，该蛋白具有特异的免疫反应性，为弓形虫诊断试剂盒的研制打下基础。
-
弓形虫P30基因DNA免疫小鼠诱导小鼠体液免疫应答及保护性研究
目的用重组质粒 pcDNA3-P30 免疫 BALB/c小鼠,观察其 DNA 免疫所诱导的小鼠体液免疫反应和保护性作用.方法大量制备质粒 DNA,肌肉注射免疫小鼠.ELISA 测定 IgG 抗体滴度;免疫鼠血液组织 P30 基因 PCR 扩增;弓形虫攻击感染.结果用ELIAS 法检测的抗体 IgG 滴度1∶2560,免疫后3周及6个月从免疫鼠血液组织中检测到 P30 基因;攻击感染实验组的存活时间较对照时间延长(P＜0.05),结论重组质粒pcDNA3-P30 免 BALB/c 小鼠可诱导一定的体液免疫应答,对抗攻击感染具有一定的保护性.
-
弓形虫表面抗原P30与免疫佐剂CTA2/B复合基因在毕赤酵母中的分泌表达
目的:探讨毕赤酵母能否高效表达具有生物学活性的弓形虫主要表面抗原P30与免疫佐剂CTA2/B重组蛋白(P30-CTA2/B).方法:将目的基因定向亚克隆入pGAPZαA表达载体,构建酵母表达载体pGAPZαA-P30-CTX;线性化重组酵母表达载体,电穿孔法导入毕赤酵母GS115,抗生素Zeocin筛选、PCR法鉴定阳性转化子;酵母工程菌摇瓶表达,取上清液行SDS-PAGE和Western blotting分析.结果:在毕赤酵母菌中分泌表达P30-CTA2/B重组蛋白,产量高达0.57 g/L;SDS-PAGE显示其在49000处有一条明显表达蛋白条带,Western blotting显示表达蛋白具有P30抗原特异性.结论:大量具有免疫活性的P30-CTA2/B重组蛋白在毕赤酵母中表达,为弓形虫亚单位复合疫苗的研制和大规模动物实验创造了条件.
-
RH株弓形虫表面抗原p22基因与p30基因联合表达后的免疫活性
目的:研究弓形虫表面抗原p22基因与p30基因的联合表达.方法:用RT-PCR及PCR方法获得p22和p30基因,联合构建在表达载体中,经酶切与测序鉴定后,用IPTG对工程菌进行诱导表达,表达产物行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳及Western-blot免疫印迹检测.结果:经RT-PCR可得到长约438bp的p22外显子基因片段,蛋白电泳结果显示,阳性重组菌在66.5Kda位置上明显多一条带,此条带可与p22抗体结合并使免疫印迹显示阳性结果.结论:弓形虫表面抗原p22基因的有效基因片段与p30基因片段联合表达后,在融合蛋白中仍具有免疫原性.
-
弓形虫表面抗原P22、P30复合基因在原核细胞中表达的研究
目的:对含有P22、P30复合基因的重组菌进行IPTG诱导表达,进而检测复合基因的融合表达产物的免疫活性.方法:用IPTG对工程菌进行诱导表达,表达产物行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳及Western-Blot免疫印记检测.结果:蛋白电泳结果显示,阳性重组菌比阴性菌在66.5 KDa位置上明显多一条带,此条带可与P30抗体结合并使免疫印记显示阳性结果.结论:含有P22、P30基因片段的质粒重组体经诱导表达出融合蛋白,其内的组分蛋白P30具有与其相应抗体结合的能力.
-
弓形虫P30基因非融合蛋白表达的研究
目的:构建弓形虫主要表面抗原P30基因的原核表达载体并在E.coli中进行表达.方法:采用定向克隆的方法,将PCR扩增得到的P30片段,插入原核表达质粒pBV220上,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,于氨苄LB培养平板上筛选阳性克隆,经过酶切及PCR扩增鉴定重组子.将含阳性重组子pBV220-P30的工程菌经温度诱导表达,SDS-PAGE电泳及免疫印迹分析.结果:成功构建了pBV2200-P300重组质粒;SDS-PAGE电泳及Western-blot显示表达P30非融合蛋白的分子量为29kD,且能被弓形虫高免鼠血清识别.结论:从弓形虫基因组DNA中获取P30基因,并成功构建了pBV220-P30重组质粒,诱导表达了P30非融合蛋白.对弓形虫病基因疫苗研制奠定了基础.
