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大肠杆菌表达的新一代重组人内皮抑素复性条件的优化
目的 优化新一代重组人内皮抑素(rhED)的复性方案并检测其抗血管生成活性.方法 用6 mol/L盐酸胍溶解rhED包涵体后,用稀释法与透析法相结合的方法进行复性,优化适复性条件.复性结束后用阳离子交换层析纯化.并用rhED特异性单抗和鸡胚绒毛尿囊膜实验检测复性后蛋门的活性.结果 通过优化复性条件,rhED的复性率可达到46%.复性、纯化后的rhED能与rhED特异性单抗反应,并在鸡胚绒毛尿囊膜实验中显示出抑制血管生长的活性.结论 提高rhED复性率的复性条件可极大地促进新一代rhED的临床前及临床研究.
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重组人内皮抑素的大鼠药代动力学研究
目的 研究大鼠静脉注射重组人内皮抑素(recombinant human endostatin,rbEndostatin)药代动力学、组织分布及排泄.方法 采用125I标记rhEndostatin示踪法,测定生物样品总放射性(radioactivity,RA法)和三氯醋酸沉淀蛋白后的放射性(trichloroacetic acid-radioactivity,TCA-RA法)以研究药物代谢过程.结果 大鼠静脉注射rhEndostatin 5、10和20mg/kg后,血药浓度和药物时间曲线下面积(area under the serum concentration-time curve,AUC)均随剂量增加而增大；TCA-RA法测定3个剂量的平均消除半衰期(elimination half-life,t1/2β)和平均清除率(systemic clearance,CL)变化不大,t1/2β为(243～265 min)、CL为(2.4～2.6 mL· kg-1·min-1).大鼠静脉注射rhEndostatin 10 mg/kg后,以肾脏含药量高,脑、肌肉和脂肪的含药量低.96h内由尿累积排泄量占给药总量的86.9％,粪中可回收到给药量的5.8％,尿和粪的总回收率达到92.7％；24 h内由胆汁排出的药量占给药量的1.3％.结论 大鼠静脉注射rhEndostatin不同剂量后,药物消除基本符合线性动力学特征；组织分布星特异性靶向分布(以肾脏含药量高),也基本反映了rhEndostatin主要经肾由尿排泄的途径消除.
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顺铂与重组人内皮抑素不同联合用药方案对裸鼠卵巢癌的疗效
目的 寻找重组人内皮抑素(rhES)使卵巢癌荷瘤鼠瘤组织微血管正常化时间窗.方法 建立卵巢癌移植瘤模型,通过动态观察重组人内皮抑素用药后肿瘤微血管α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),Ⅳ型胶原(CollagenⅣ)及缺氧诱导因子-1 α(HIF-1α)表达变化,确定rhES使肿瘤微血管正常化时间窗.按rhES使肿瘤微血管正常化时间窗前、中、后3个时间段分别给予顺铂治疗并设对照,通过抑瘤率,微血管密度(MVD),肿瘤细胞增殖活性等方面评价疗效.结果 在rhES用药第4、6天肿瘤微血管趋于成熟,基底膜,周细胞增加,α-SMA阳性表达微血管数与对照组比较明显升高,分别为(15.3±5.2)比(4.3±2.1)个/mm2 (P ＜0.01)；(16.4±4.6)比(6.6±2.4)个/mm2(P ＜0.01),Ⅳ型胶原阳性表达的微血管与对照组相比也明显升高,分别是(14.7±4.3)比(6.7±5.1)个/mm2(P＜0.01)；(18.4±5.5)比(7.1±1.7)个/mm2 (P ＜0.01).在rhES用药第4、6天肿瘤乏氧区HIF-1α表达降低.rhES+ DDP(d4 ～6)组与其他各组比较抑瘤率高,微血管密度降低,增殖核抗原(PCNA)表达下降.结论 rhES使卵巢癌移植瘤微血管正常化时间窗为用药第4～6天,在该时间段与顺铂联合用药治疗效果佳.
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内皮抑素治疗宫颈癌的研究进展
宫颈癌是我国常见的妇科恶性肿瘤之一,早期根治性手术和放疗会有满意的效果,然而晚期(Ⅱb-Ⅳa)、复发及转移性宫颈癌对各种治疗手段都不敏感.重组人内皮抑素(恩度)是一种新型重组人血管内皮抑制药物,可以抑制血管内皮的增殖和迁移,从而抑制肿瘤新生血管.本文为重组人内皮抑素治疗宫颈癌的研究总结.
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重组人内皮抑素对食管癌细胞生长抑制作用的体外研究
目的:探讨重组人内皮抑素(rhES)对食管鳞癌系KYSE- 150及TE1细胞生长的影响.方法:应用四甲基偶氮唑盐(MTT)法,以大鼠成纤维细胞L929为对照细胞,检测rhES不同浓度(0、12.5、25、50、100、200、400、600 μg/ml)和作用时间(24h、48h)对食管鳞癌系KYSE- 150、TE1和L929细胞的生长抑制作用.结果:大鼠L929细胞经rhES处理后,吸光度A值轻微降低,差异不具有统计学意义(P＞0.05),食管鳞癌系KYSE- 150、TE1经rhES处理后,吸光度A值明星降低,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论:rhES明显抑制食管鳞癌系KYSE- 150及TE1细胞增殖,且呈时间-剂量依赖性.
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重组人内皮抑素联合TP方案对MCF-7裸鼠移植瘤的影响
目的:探讨重组人内皮抑素联合TP方案对MCF-7裸鼠移植瘤模型血管生成及肿瘤生长的作用.方法:将36只荷瘤鼠随机分为A、B两大组,A、B两大组内均设有单一化疗组、联合用药组及对照组;单一化疗组给予紫杉醇+顺铂(TP方案).联合用药组给予重组人内皮抑素+TP,对照组等体积生理盐水;比较A大组内各组裸鼠的抑瘤率,肿瘤生长曲线.ELISA方法检测血清血管内皮生长因子(VEGF),取肿瘤组织病理切片观察微血管密度(MVD)、凋亡指数,并观察B组所有动物生存期.结果:联合用药组VEGF,MVD,较单一化疗组及对照组低,凋亡指数比单一化疗组高,有统计学差异(P＜0.05),联合用药组与化疗组生存时间的差异无统计学意义(P＞0.05),与对照组比较有统计学差异,生存时间较对照组长(P＜0.05).结论:重组人内皮抑素联合TP方案对MCF-7裸鼠移植瘤对肿瘤生长及肿瘤血管抑制优于单一化疗,但1个周期联合化疗用药不能延长生存期.
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TNP-470联合重组人内皮抑素抑制小鼠肺腺癌生长的研究
目的:观察TNP-470和重组人内皮抑素(recombinant human endostatin,rhES)联合治疗对小鼠肺腺癌LA795肿瘤生长的抑制作用.方法:用甲醇诱导能高效分泌表达重组人内皮抑素(rhES)的毕赤酵母菌株分泌表达rhES,将皮下接种LA795肺腺癌细胞的T739雄性近交系小鼠随机分成3组,每组各10只,分别给予PBS,rhES及TNP-470+rhES皮下注射,每日1次,连续14 d;观察各组小鼠肿瘤生长情况,游标卡尺测量肿瘤体积大小.断颈处死小鼠,原位肿瘤免疫组化观察肿瘤内部微血管密度(microvessel density,MVD).结果:经甲醇诱导,毕赤酵母重组菌分泌表达rhES,并应用肝素亲和层析将其纯化;动物试验显示与PBS对照组比较,rhES治疗组及rhES+TNP-470治疗组均明显抑制小鼠肿瘤的生长(P＜0.01),TNP-470+rhES组与rhES组比较亦有显著性差异(P＜0.01).原位肿瘤免疫组化显示联合治疗组抑制血管生成更显著(P＜0.01).结论:TNP-470联合rhES治疗对小鼠肺腺癌LA795生长的抑制效果比单独使用rhES的治疗效果更佳,具有良好的协同治疗作用.
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重组人血管内皮抑素联合肝动脉灌注化疗栓塞治疗中晚期肝癌的临床应用
目的 研究重组人血管内皮抑制索(内皮抑素)联合肝动脉TACE治疗中晚期肝癌的临床疗效及安全性.方法 选取40例中晚期肝癌患者,随机分成两组.治疗组常规TACE加重组人内皮抑素-碘化油乳剂栓塞;对照组单纯给予常规TACE.所有患者术后1年内不定期复查CT或MRI,以及DSA检查.观察肿瘤复发或转移情况以及有无肿瘤新生血管形成.比较瘤体缩小情况,AFP变化,6个月、1年的生存率以及生活质量.同时比较两组术后不良反应.结果 治疗组1年生存率、AFP下降程度显著高于对照组,治疗组与对照组1年生存率分别为75%(15/20)和60%(12/20);AFP下降值平均差为300μg/ml;肿瘤新生血管、转移抑制明显.结论 内皮抑索联合TACE治疗中晚期肝癌,患者1年生存率显著提高,AFP下降明显,肿瘤新生血管、转移抑制明显,且安全,具有较好的临床应用前景,值得临床进一步研究.
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重组人内皮抑素PEG-PE胶束的制备及抑瘤效应研究
目的:内皮抑素是强效的血管内皮细胞生长抑制剂,但其低溶解度限制了临床应用,通过采用聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)制备包载重组人内皮抑素的胶束,以期寻找内皮抑素的新药物载体.方法:研究PEG-PE内皮抑素胶束的理化性质,观察PEG-PE内皮抑素胶束对体外肿瘤细胞生长的作用及对鸡胚绒毛尿囊体内血管生长的影响.结果:制备的PEG-PE-内皮抑素胶束的粒径为(48.32±8.29)nm,Zeta电位为+3.2 mV.包封率为75%,该胶束可以抑制MCF-7肿瘤细胞的生长和增殖,内皮抑素浓度50 μg·mL-1时抑制率为31.4%,对鸡胚绒毛尿囊血管新生也有明显的抑制作用.结论:同单独用内皮抑素比较,用PEG-PE胶束作为药物载体运送内皮抑素直接抑制肿瘤细胞生长和抑制新生血管形成的效果更明显.
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重组人内皮抑素工程菌发酵条件的优化
重组人内皮抑素(rhEndostatin)是人内皮抑素经过基因突变获得的新的蛋白质序列,是一种血管生成抑制剂类蛋白,具有抗肿瘤活性.实验对蛋白rhEndostatin产生菌E. coli BL21(DE3)的基本发酵条件进行了研究并用正交试验对培养基成分进行了优化,优化后的培养基组成为:蛋白胨1%,酵母粉0.5%,葡萄糖0.5%,NaC1 0.2%,Na2 HPO4·12H2O 1.5%,KH2PO4 0.2%,(NH4)2SO4 0.2%,MgSO4·7H2O 0.02%,VB15mg/L,VB2 1 mg/L,微量元素:CoCl2·6H2O 5 mg/L,MnCl2·4 H2O,H3BO3,Na2MoO4·2H2O,AICI3·6H2O,Ferric citrate均20 mg/L.优化后的培养基在发酵罐发酵,湿菌重达到45 g/L以上,目的蛋白产量达324 mg/L,为rhEndostatin的进一步研究开发打下了基础.
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人内皮抑素在毕赤酵母中的组成型表达及其活性检测
为获得大量具有生物学活性的重组人内皮抑素(Endostatin),在毕赤酵母中进行组成型表达的研究.将由毕赤酵母偏爱密码子组成的Endostatin cDNA插入组成型载体pGAPZαA中,构建表达载体pGAPZαA-ENDO,并转化到毕赤酵母X-33中.重组菌株在甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)启动子的调控作用下,进行组成型表达Endostatin蛋白.重组人Endostatin产量达到102mg/L.Western blot显示:表达蛋白能与兔抗Endostatin的多克隆抗体特异性结合.纯化后的重组Endostatin具有抑制人血管内皮细胞系ECV-304细胞增殖的活性.利用毕赤酵母组成型表达系统能获得大量具有生物活性的Endostatin蛋白.
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重组人内皮抑素联合顺铂化疗对恶性黑色素瘤MVD及VEGF的影响探究
目的 探究重组人内皮抑素联合顺铂化疗对恶性黑色素瘤微血管的密度(microvessel density,MVD)及内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的影响.方法 选取第二军医大学长征医院整形科收治的预手术恶性黑色素瘤患者80例,随机分为2组,其中对照组40例,给予顺铂30 mg/m2,第1天和第8天静滴,为1个周期,间隔3周重复,共治疗2个周期;实验组40例,在对照组治疗的基础上加用重组人内皮抑素(恩度)15 mg/d静滴.治疗结束后,对比治疗前后患者黑色素瘤组织中MVD及VEGF的表达水平及临床疗效.结果 治疗前2组MVD和VEGF计数差异无统计学意义;治疗后,与对照组比较,实验组MVD和VEGF计数均显著降低(P＜0.05);治疗后,实验组的有效率(87.5％)显著高于对照组(70.0％),差异有统计学意义(P＜0.05).结论 重组人内皮抑素联合顺铂化疗能够明显降低恶性黑色素瘤组织中MVD及VEGF的表达,提高临床疗效.
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Endostar体外稳定性研究
目的:比较重组人内皮抑素恩度~(TM)(Endostar~(TM))和毕赤酵母表达的内皮抑素(endostatin)在不同温度及不同pH条件下的稳定性,通过检测对内皮细胞的增殖抑制比较Endostar在4 ℃和37℃下的生物活性.方法:将Endostar和endostatin于4 ℃保存或37℃放置96 h后进行不同条件的聚丙烯酰胺凝胶电泳,比较Endostar和endostatin之间以及它们在不同温度放置后的电泳行为,采用兔源多克隆抗体进行Western blot验证.同时检测在两种温度下的Endostar对于人脐静脉内皮细胞HUVEC细胞增殖的抑制作用.结果:在还原性电泳中Endostar和endostatin在20 kD左右处均只出现一条带.在3种酸性非还原电泳条件下,endostatin出现明显的"smear"现象,无法观察到主要条带,Endostar在酸性不连续非还原电泳条件下只出现一条带,而在两种连续非还原电泳中虽然也出现"smear"现象,但是主要条带仍然存在,Endostar和en-dostatin在37℃放置96 h后与它们保存在4℃的样品相比,在各种电泳条件下有相似的电泳行为,Western blot验证了相应电泳的结果.在两种温度下的Endostar对于HUVEC的增殖抑制作用基本相同.结论:Endostar和endostatin具有相似的热稳定性,但在酸性条件下Endostar较endostatin更为稳定.
关键词： 非还原性电泳 恩度 endostatin 重组人内皮抑素 稳定性 -
重组人血管内皮抑素联合顺铂治疗鼠B16恶性黑色素瘤移植模型的实验研究
目的 探讨重组人内皮抑素(恩度)联合顺铂化疗对恶性黑色素瘤的作用.方法 建立B16恶性黑色素瘤的裸鼠移植模型20只,随机分为恩度组、顺铂组、恩度联合顺铂组(联合组)和对照组.治疗后处死裸鼠,计算肿瘤体积抑瘤率,用免疫组化法测微血管密度(MVD)及瘤体血管内皮生长因子(VEGF)的表达.结果 恩度组、顺铂组和恩度联合顺铂组(联合组)的肿瘤抑制率分别为17.52%、45.72%和59.40%,联合组的肿瘤生长明显受到抑制(P＜0.05).免疫组化结果显示,联合组MVD低于其他组(P＜0.05);恩度组、顺铂组和联合组的VEGF表达均明显低于对照组(P＜0.05).结论 恩度联合顺铂有协同抗肿瘤作用,能有效抑制恶性黑色素瘤的生长.
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重组人血管内皮抑素联合化疗治疗乳腺癌的实验研究
目的 研究重组人血管内皮抑素联合化疗方案对人乳腺癌裸鼠移植瘤模型的治疗效应,并进一步探讨其抑制肿瘤血管生成的作用机制.方法 将乳腺癌荷瘤裸鼠40只随机分为4组,分别为化疗组、内皮抑素组、联合用药组及对照组.化疗组给予长春瑞滨和顺铂；内皮抑素组给予重组人血管内皮抑素；联合用药组给予长春瑞滨,顺铂,和重组人血管内皮抑素；对照纽给予等量的生理盐水.给药期间测量肿瘤大小,实验结束取肿瘤称重,计算肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线并比较各组的抑瘤率.免疫组化方法检测各组肿瘤组织微血管密度(MVD),VEGF,HIF-1α及P53的表达.结果联合用药组抑瘤率为64.63％,化疗组抑瘤率为35.47％.联合用药组与其他3组MVD计数比较明显减少,差异有统计学意义(P＜0.05).与对照组及化疗组相比,联合用药组的VEGF、HIF-1t和P53的表达均明显减少,其差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 重组人血管内皮抑素联合化疗能够有效控制裸鼠乳腺肿瘤生长,降低肿瘤MVD,其机制可能为下调VEGF及HlF-1α的表达.内皮抑素对P53的作用机制有待于更进一步的研究.
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重组人内皮抑素抑制角膜新生血管的实验研究
目的 研究重组人内皮抑素(rHES)对碱烧伤诱导大鼠角膜新生血管(CNV)的抑制效应.方法 60只Wistar大鼠按随机数字表法分为正常组、阳性对照组、rHES组3组,每组各20只.阳性对照组右眼角膜碱烧伤后不治疗;rHES组右眼角膜碱烧伤后立即100 mg/mL rHES点眼,每日3次;20只正常鼠不做任何干预处理作为正常组.观察碱烧伤后1、4、7、10、14 d各组角膜情况及CNV的生长面积.碱烧伤后第16天处死动物,取角膜行组织病理学检查.免疫组织化学、PCR检测血管内皮生长因子(VEGF)蛋白量和mRNA在角膜组织的表达,透射电镜下检查碱烧伤后角膜组织的超微结构变化.结果 rHES组角膜在碱烧伤后各时间点新生血管面积均小于阳性对照组(t4 d=3.294,P=0.040;t7 d=5.391,P=0.000;t10 d=6.560,P=0.000;t14 d=10.346,P=0.000).角膜碱烧伤后第16天各组VEGF蛋白表达量的差异有统计学意义(F＝337.62,P＝0.00),各组VEGF mRNA表达量的差异有统计学意义(F＝114.43,P＝0.00).透射电镜检查显示正常组结构正常,rHES组较阳性对照组角膜结构变化小.PCR结果 发现rHES组VEGF mRNA的相对表达量低于阳性对照组,但高于正常组.结论 rHES用于眼表可有效抑制碱烧伤诱导的CNV.
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重组人内皮抑素对结肠癌细胞SW620增殖和凋亡的影响
目的 观察重组人内皮抑素对结肠癌细胞SW620增殖和凋亡的影响.方法 在培养液中加入梯度浓度的重组人内皮抑素(0.1、0.5、1.0,5.0、10.0、20.0mg/L)分别作用24、48、72 h,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞生长,流式细胞术检测细胞周期和凋亡,扫描及透射电镜观察细胞超微结构的变化.结果 内皮抑素对SW620细胞的增殖有抑制作用.其中,作用48 h的抑制率分别为13.46%、15.38%、20.82%、24.71%、30.12%和37.44%,呈剂量依赖关系.给药后24 h和48 h,内皮抑素组细胞G0/G1期比例增高,而s期细胞比例降低(P＜0.05).72h两组差异无统计学意义(P＞0.05).24 h和48 h的凋亡率分别为(1.430±0.145)%和(1.760±0.054)%,均高于对照组(0.670±0.181)%和(1.260±0.138)%(P＜0.05).透射电子显微镜下,内皮抑素组细胞微绒毛减少,染色质厚薄不均,位于核膜下.结论 重组内皮抑素可以在体外直接抑制结肠癌细胞的增殖,诱导凋亡,影响细胞骨架等结构.
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重组人内皮抑素联合顺铂化疗治疗恶性黑色素瘤的临床疗效及对MVD、VEGF水平的影响
目的:探讨重组人内皮抑素联合顺铂化疗治疗恶性黑色素瘤的临床疗效及对恶性黑色素瘤微血管密度(MVD)和内皮生长因子(VEGF)水平的影响.方法:按照随机数字表法将2008年3月-2015年3月我院收治的恶性黑色素瘤患者分为两组,对照组予以30 mg/m2的顺铂化疗,观察组在对照组基础上静脉滴注重组人内皮抑素15mg/d,治疗2个周期后比较两组的临床疗效和对MVD、VEGF计数的影响.结果:观察组临床疗效优于对照组,差异有统计学意义(Z=-2.673,P=0.008).治疗后两组MVD、VEGF计数较治疗前均下降,且观察组下降更明显,差异均有统计学意义(t=3.759,4.082;P＜0.05).两组不良反应发生率差异无显著性(P＞0.05).结论:重组人内皮抑素联合顺铂化疗治疗恶心黑色素瘤能明显提高临床治疗效果,抑制恶性黑色素瘤组织中的MVD和VEGF表达.
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重组人内皮抑素对鼻咽癌细胞CNE2增殖及凋亡的影响
目的 探讨重组人内皮抑素(rh-endostatin,rh-ES)对鼻咽癌CNE2细胞增殖、凋亡的影响.方法 分别以25、50、100、200、400 μg/ml的rh-ES体外处理人鼻咽癌细胞株CNE2,同时设空白对照组和细胞对照组.利用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测不同浓度和时间rh-ES作用下的细胞增殖状态;流式细胞仪检测细胞周期及凋亡;透射电镜观察CNE2细胞超微结构的变化.结果 ①MTT检测显示rh-ES(25 ～ 400 μg/ml)能抑制CNE2细胞的增殖,不同浓度的rh-ES对人鼻咽癌细胞株CNE2具有不同程度的生长抑制作用,且存在时间剂量效应,以400 μg/ml rh-ES作用72 h后抑制效果为显著,各浓度组相比差异具有统计学意义.②流式细胞仪检测结果发现与CNE2细胞对照组相比,rh-ES实验组处于细胞周期G0/G1期的细胞明显增多,细胞凋亡率增加(P＜0.05).③电镜观察,rh-ES实验组CNE2细胞出现凋亡特征,细胞和细胞器皱缩,核染色质边集碎裂,核膜消失.结论 rh-ES能显著抑制鼻咽癌细胞CNE2细胞的增殖,并具有时间-剂量依赖性,其主要机制可能为诱导细胞凋亡,调整细胞周期分布.
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重组人内皮抑素结合化疗对晚期非小细胞肺癌患者血清LMTK-3、IGFBP-7的影响
目的 探讨重组人内皮抑素结合化疗对晚期非小细胞肺癌患者血清Lemur酪氨酸激酶3 (LMTK- 3)、胰岛素样生长因子结合蛋白7 (IGFBP-7)的影响.方法 选取2012年1月-2015年1月于该院收治的 NSCLC患者86例为研究对象,按随机数字表法分为观察组和对照组,每组43例.对照组患者采取吉西他滨+顺铂化疗.观察组在对照组基础上联合恩度治疗.对两组患者的临床疗效、不良反应、外周血血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子1 (IGF-1)、LMTK-3、IGFBP表达水平进行评价.结果 观察组治疗客观有效率、总有效率高于对照组(P＜0.05),观察组的疗效优于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).两组患者的不良反应发生率并差异无统计学意义(P＞0.05).两组患者治疗后VEGF、IGF-1及LMTK-3水平较治疗前更低,GFBP水平较治疗后更高,差异有统计学意义(P＜0.05),且观察组治疗后VEGF、IGF-1及LMTK-3水平较对照组更低,IGFBP-7更高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 重组人内皮抑素联合化疗可有效降低 NSCLC患者的血清LMTK3水平,升高血清IGFBO-7水平,患者的疗效良好,不良反应较低.
