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多系统萎缩的临床与病理特点及诊断
目的 探讨多系统萎缩(multiple system atrophy,MSA)的临床和病理特点及诊断.方法 总结4例MSA患者资料,其中2例为病理资料,2例为临床资料.经解剖检验证实的MSA患者2例,通过苏术素-伊红(HE)、髓鞘染色(KB)及Gallyag-Braak(GB)银染色,并通过泛素、α-突触核蛋白等免疫组织化学染色进行观察.结果 4例患者均为男性,年龄分别为76、70、51及59岁.临床诊断:例1为帕金森综合征,例2为脊髓小脑共济失调,例3、例4均诊断为MSA.病理改变的大体所见:脑桥和小脑明显萎缩,壳核、苍白球、黑质也可见萎缩,脑室扩张.组织学所见:大脑皮质、黑质、纹状体、苍白球、脑桥核、下橄榄、无名质、迷走神绛背核、小脑、脊髓中间外侧角细胞及前角细胞等部位神经细胞脱失,胶质增生,上述部位自质可见广泛弥漫的少突胶质细胞胞质内缠结样包涵体.结论 临床上橄榄-脑桥-小脑萎缩常以脑桥、小脑及自主神经症状为主,Shy-Drager综合征以直立性低血压症状为主,纹状体黑质变性常以锥体外系症状为主.因上述3个疾病有共同的病理基础,故倾向于将其归为MSA的亚型.
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多系统萎缩的诊断与治疗进展
早Bradburg和Eggtestoton提出"姿位性低血压"概念,Shy和Drager首先报道该病病理,Chokroverty命名为现用的"原发性直立性低血压" (primary orthostatic hypotension,POH)术语.但POH除直立性低血压(OH)表现外,还有尿便障碍、汗少、阳痿等其他自主神经受累,还有小脑及锥体外系受累表现,故Graham 和Oppenheimer提出多系统萎缩(multiple system atrophy,MSA)概念,是指神经系统多个部位相继病变,过去分为Shy-Drager综合征(SDS)或POH、橄榄脑桥小脑萎缩(OPCA)、纹状体黑质变性(SND)三个实体,三者在发展到后期,临床表现有重叠.近年来病理证实三者有同样的神经组织胞质内包涵体[1],故现在一般只用MSA,可不用上述三种具体名词.
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蛋白酶体抑制剂诱导帕金森病PINK1蛋白聚集物的形成与特征
目的 研究在蛋白酶体抑制剂作用下,帕金森病PINK1蛋白聚集物的形成及其特征.方法 应用PCR从胎脑cDNA文库扩增全长PINK1基因,亚克隆至增强型绿色荧光蛋白载体(pEGFP-N1),经测序证实载体构建正确.PINK1-pEGFP-N1表达载体转染非洲绿猴肾细胞株(COS-7细胞),应用MG-132抑制蛋白酶体活性,Western blot检测PINK1蛋白表达量,荧光染色观察PINK1蛋白是否形成蛋白聚集物,免疫荧光观察构成Lewy小体的两种主要成分:泛素和α-突触核蛋白是否存在于蛋白聚集物中.结果 应用MG-132诱导后PINK1蛋白表达量明显增加,PINK1蛋白形成了蛋白聚集物,泛素和α-突触核蛋白与PINK1蛋白聚集物共定位.结论 在蛋白酶体抑制剂作用下,PINK1蛋白可形成蛋白聚集物,泛素和α-突触核蛋白是其组成成分.
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散发性包涵体肌炎七例临床及病理特点
目的 探讨散发性包涵体肌炎(sIBM)患者的临床及病理诊断规律.方法 收集7例于2001年至2005年就诊并明确诊断为sIBM的患者临床、病理资料,发病年龄为41～75岁,平均57.4岁,病程2～10年,平均5.4年.全部患者均有股四头肌无力和萎缩,4例出现肢体远端无力,1例出现延髓部和颈部无力.其中伴随高血压和腔隙性脑梗死者2例,伴随脑出血、周围神经病和糖尿病各1例.7例患者均进行了肌肉活体组织检查标本的组织学、酶组织化学染色,5例进行电镜检查,3例进行了tau蛋白免疫组织化学染色.结果 7例患者肌酶均升高,但未超过正常上限8倍.肌电图检查示5例呈肌源性损害,2例呈神经源性损害.所有患者的骨骼肌病理改变主要是肌内衣炎细胞浸润、肌纤维直径变异加大和镶边空泡(出现率2%～10%),5例出现不整红边纤维,3例有细胞色素C氧化酶染色阴性肌纤维.5例进行电镜检查者均存在管丝包涵体.3例免疫组织化学染色者均显示肌纤维内tau蛋白沉积.结论 sIBM以股四头肌损害明显,常合并其他老年性疾病.肌纤维内出现tau蛋白也可以作为该病诊断标准之一.
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多系统萎缩的量表评估
多系统萎缩(multiple system atrophy,MSA)是一种散发的进行性神经系统变性疾病,近年来受到国内外神经科学领域临床和基础研究者的广泛关注.MSA临床表现包括自主神经功能障碍、帕金森综合征、共济失调和锥体系统功能障碍等,病理表现为中枢神经系统多个部位的神经元丢失,少突胶质细胞胞质α-共核蛋白阳性包涵体[1-2].
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眼咽型远端型肌病二家系的临床、病理及分子学特点
目的 探讨2个眼咽型远端型肌病(OPDM)家系的临床、病理及分子生物学特点.方法 对2个家系的先证者行血清肌酶、肌电图、肌肉活体组织检查、肌肉酶组织染色及电镜分析,并于复诊时提取其静脉血DNA样本,进一步行编码多聚腺苷酸结合蛋白核1(PABPN1)、GNE基因突变分析.结果 家系1为同代3兄弟发病,家系2为2代4人发病.起病以发音困难伴双下肢无力居多；以发音及吞咽困难为表现的咽部肌群受累较突出.肌肉超微结构电镜分析未见到眼咽型肌营养不良样核内包涵体,2家系先证者PABPN1基因GCN重复拷贝数均为正常(10次,GCG6GCA3GCG1),且GNE基因2～12号外显子均未发现突变.结论 2个OPDM家系起病年龄、形式与日本患者类似,但肌肉受累方式有所不同.家系1为中国首个常染色体隐性遗传OPDM家系.本研究结果证实OPDM是一个表型、病理、遗传学独立的肌病实体.
关键词： 肌疾病 肌营养不良 眼咽 包涵体 Poly(A)结合蛋白质Ⅱ -
多系统萎缩的预警信号
多系统萎缩(MSA)是散发性神经变性病,组织病理特征为α-突触核蛋白阳性胶质细胞质包涵体,临床表现为帕金森综合征、小脑和自主神经系统功能障碍的不同组合.
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包涵体肌炎11例临床及组织病理报告
目的探讨包涵体肌炎的诊断标准.方法分析了11例包涵体肌炎病人的临床表现、组织化学.碱性刚果红染色 9例,电镜检查2例.结果全部病人均在42岁后发病,表现为远、近端肌肉力弱,2例肌电图检查显示肌源性改变,11例均有边缘着色性空泡及炎性改变,9例有淀粉样蛋白沉积物,有胞核或胞质细丝包涵体各1例.结论包涵体肌炎的所有诊断指标中,无一项有决定性或特征性,需要进行综合判断.
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多系统萎缩17例临床分析和一例尸检报告
目的分析多系统萎缩的临床、病理特点和诊断标准.方法按Gilman诊断标准,回顾性分析了17例多系统萎缩的临床资料和其中1例病理资料.结果按Gilman诊断标准,本组17例中,确诊多系统萎缩1例,拟诊12例,可疑者4例.首发症状表现为植物神经功能障碍者8例,锥体外系体征8例.病程中出现姿位性低血压的有12例;排尿障碍16例,阳痿9例;帕金森综合征症状12例;共济失调13例;皮质脊髓束损害12例.头颅MRI发现10例脑萎缩.1例经尸检证实存在少突胶质细胞包涵体.结论多系统萎缩是累及植物神经、锥体外系、小脑和皮质脊髓束,并具少突胶质细胞包涵体等特定神经病理表现的变性疾病.Gilman诊断标准具有较强的临床可操作性.
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巨细胞病毒感染、包涵体形成与生精细胞凋亡及不育症
本文就巨细胞病毒感染的病原学、流行病学、传播途径、发病机制、细胞病变效应和包涵体侵入细胞过程进行了介绍.对血管内皮细胞脂质体的形成,多发性骨髓瘤浆细胞内包涵体类型,精液中生精细胞内检出的6种包涵体类型和形态特征进行了描述.由病毒感染对精子运动的影响和生精细胞凋亡与男性不育,进行报道.
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p185HER-2蛋白胞外区的表达及其结合肽的筛选
目的:构建p185HER-2蛋白胞外区的原核表达载体,实现p185HER-2蛋白胞外区的表达.以纯化p185HER-2蛋白胞外区为靶,从噬菌体肽库中筛选其结合肽,用于肿瘤导向治疗.方法:从含有HER-2全长cDNA的质粒psv2-cerbB-2中克隆了人p185HER-2蛋白胞外区cDNA,将此cDNA克隆到pET-30a+表达载体中,构建p185蛋白胞外区的表达载体.表达的p185HER-2蛋白胞外区通过Zn2+螯合层析柱进行纯化.以纯化的p185HER-2蛋白胞外区为靶,通过淘洗方法进行噬菌体肽库筛选.结果与结论:构建了p185HER-2蛋白胞外区的原核表达载体,实现了p185HER-2蛋白胞外区的高表达.通过Zn2+螯合层析柱实现一步纯化,p185HER-2蛋白胞外区的纯度达到95%.从噬菌体随机环七肽库中找到了一组具有核心序列p185HER-2蛋白胞外区结合肽.这些p185HER-2蛋白胞外区结合肽有可能成为肿瘤治疗的新的候选分子.
关键词： p185HER-2蛋白 包涵体 噬菌体肽库 结合肽 -
新型重组IL-6 D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白复性及纯化
目的:对高效表达的重组IL-6 D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白进行包涵体的分离、变性与复性以及纯化.方法:对表达菌体进行超声破碎、洗涤、氧化还原法变性及复性,经离子交换层析.结果:工程菌HB101/pE01T的表达产物是以包涵体形式存在,菌体的破碎以高渗蔗糖溶液进行预处理后,再超声破碎效果好;包涵体的洗涤则先用Triton-X-100洗2次,再用8 mol/L尿素洗涤一次效果更优;佳变性条件为在7 mol/L盐酸胍中加入 0.065 mmol/L的DTT和0.2 mol/L的盐酸精氨酸;佳复性条件为在10℃复性保持24 h,蛋白浓度保持在30～ 80 μg/ml,并需加入0.2 mol/L盐酸精氨酸;利用谷胱甘肽的氧化还原法,当氧化型谷胱甘肽与还原型谷胱甘肽的浓度比在 2∶ 1时所获得的活性成分得率高;利用强弱离子交换结合的方法能获得纯度为95%的目的蛋白,所得融合蛋白可与IL-6及PEA抗体相结合并能特异性地杀伤高表达IL-6R的人多发性骨髓瘤细胞.结论:本研究获得重组IL-6 D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白包涵体的分离、变性与复性条件和一条能获得大量高纯度该融合蛋白的纯化路线.
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HLA-B*2705分子结构对其在原核细胞可溶性表达影响的研究
目的 研究人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)-B*2705分子结构对其在原核细胞可溶性表达的影响.方法 采用RT-PCR法将HLA-B * 2705基因的全长、胞外区和α1、α2功能区分别进行克隆并连接到pET-32a(+)表达载体.经IPTG诱导表达,并经超声破碎、层析和透析纯化蛋白,再经体外微量细胞淋巴毒反应检测蛋白质活性.结果 成功构建3种pET-32a(+)表达载体,经IPTG诱导后,HLA-B* 2705基因全长和胞外区主要以包涵体的形式表达,可溶性蛋白的量较低；而α1和α2功能区则以高效可溶性形式表达,通过体外微量细胞淋巴毒实验证实,HLA-B* 2705的α1和α2功能区可溶性蛋白可与HLA-B27抗体特异性结合,并成功阻断补体介导的细胞毒作用.结论 α1和α2功能区能够在原核细胞中高效表达可溶性蛋白,并具有蛋白功能,而HLA-B* 2705基因全长和胞外区主要以包涵体的形式表达,表明蛋白质的大小和空间结构对于其可溶性表达具有重要影响.
关键词： HLA-B* 2705 分子结构 可溶性表达 包涵体 -
重组人EGF包涵体与37×103菌体蛋白的稳定性
大肠杆菌BL21(DE3)是常用的工程菌株之一,许多外源蛋白得已成功表达[1～6].以其作为宿主菌进行外源蛋白表达时,往往形成包涵体[3～5 ],包涵体结构复杂,一般含有50%以上的目的重组蛋白,其余为核糖体元件、RNA聚合酶、大肠杆菌的外膜蛋白、质粒DNA以及脂体、脂多糖等.包涵体为大小0.5～1 μm的颗粒状,难溶于水,只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等[7].包涵体的形成可抵抗菌体内蛋白酶的降解,得到较高的表达量,给后续的纯化工作带来方便[8].
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单链抗体与力达霉素辅基蛋白融合蛋白制备过程的优化
优化以包涵体形式表达的抗Ⅳ型胶原酶单链抗体与力达霉素辅基蛋白融合蛋白Fv-LDP制备过程.通过单因素或正交设计优化其包涵体制备与溶解、固定化金属螯合层析和分步透析复性过程,Sephadex G-75层析精细纯化蛋白,基于流式细胞术的饱和结合实验检测其抗原结合活性.优化后,Fv-LDP包涵体纯度为63.9％,溶解度为95.7％;纯化后Fv-LDP纯度达95％以上,复性后单体含量占60％,精细纯化后提升为85％,比初始复性条件提高5.6倍,能够与人肺腺癌PAa细胞和肝癌BEL-7402细胞结合.Fv-LDP制备过程被成功优化,为其生产和研发奠定了实验基础,也为其他以包涵体形式表达的基于单链抗体的小型化抗体药物制备提供了比较实用的方法.
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重组SARS-CoV未知功能小蛋白X5表达、纯化及抗体制备
将SARS-CoV未知功能小蛋白X5的基因在大肠杆菌中进行诱导表达,获得以包涵体形式存在的重组X5蛋白.通过高浓度尿素变性溶解包涵体,亲和层析法纯化蛋白,然后对其进行尿素梯度透析复性,终得到的蛋白纯度＞95%,终产率93.3 mg·L-1.SDS-PAGE电泳和LC-ESI-MS/MS结果表明,该重组蛋白大小与理论相符,序列与GenBank中注册的X5蛋白序列一致,说明该蛋白为目的蛋白.利用纯化的X5蛋白制备得到多克隆抗体,ELISA检测抗体效价为1:72 900,说明纯化后的蛋白对兔有很强的免疫原性.X5多克隆抗体的成功制备,为将来鉴定X5蛋白的药理学活性奠定了基础.
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v-Src蛋白在大肠杆菌中的高效表达、纯化及其活性分析
目的表达高纯度具有激酶活性的Src蛋白,为抗肿瘤药物研究提供蛋白质靶标.方法利用高效表达质粒pGEX-KT克隆v-Src全基因,诱导表达得到的GST-Src融合蛋白经Glutatione Sepharose 4B亲和层析柱纯化后,采用Western blotting和以polyGlu:Try(4:1)为底物的ELISA法鉴定其免疫原性和酪氨酸激酶活性.结果CST-Src蛋白表达量约占菌体总蛋白的30%,其中包涵体与可溶性蛋白的表达量分别约13.5和2 mg·L-1,纯度分别约98%和85%,比活约1.13和0.62nmol·min-1·mg-1.结论本法表达的GST-Src融合蛋白表达量高、纯化效果好,且具有较高的激酶比活.
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非肌性肌球蛋白重链9基因突变相关疾病:一个家系报告
目的:提高对非肌性肌球蛋白重链9基因(myosin heavy chain 9, nonmuscle,MYH9)突变相关疾病的认识.方法:报告一个MYH9相关疾病家系的临床及实验室检查资料,包括外周血和骨髓涂片的细胞形态学检查(瑞姬染色),外周血超微结构检查,流式细胞术分析血小板膜糖蛋白,应用逆转录-聚合酶链反应和直接测序的方法分析MYH9 mRNA,应用聚合酶链反应和直接测序方法分析MYH9基因.结果:患儿及其父亲均有巨大血小板、血小板减少和粒细胞内包涵体(D(o)hle样小体).患儿及其父亲血小板膜糖蛋白GPIb均轻度降低.mRNA和基因组DNA分析均证实,患儿存在杂合的碱基替代突变(5797C＞T),使第1933位密码子CGA转为终止密码子TGA.基因组DNA分析显示,其父亲携带有与患儿相同的突变.结论:本例患儿及其父亲具有巨大血小板、血小板减少、粒细胞内包涵体和MYH9基因点突变,MYH9相关疾病的诊断成立.
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抗人结肠癌单链抗体CL-3在大肠杆菌中的表达、复性和纯化
目的:为得到单链抗体高效表达,我们对抗人结肠癌单链抗体 CL-3 在大肠杆菌中的表达、复性和纯化进行了研究.方法:以重组质粒表达载体 pJW2-CL-3 转化大肠杆菌DH5α,重组克隆在培基中温控诱导,以包涵体形式表达单链抗体.包涵体经溶解、复性、纯化后,以SDS-PAGE及Western Blot鉴定表达蛋白,ELISA法鉴定单链抗体的免疫活性.结果:42 ℃诱导 5 h 蛋白表达量占菌体蛋白的 30%. 8 mol/L 尿素可将包涵体大部分溶解,稀释于复性缓冲液中静置 10 ℃ 48 h 以上可使包涵体蛋白复性.纯化峰经鉴定, 27 KD 处表达之蛋白为带有E-tag的抗人结肠癌单链抗体 CL-3,并证明其具有与抗原CEA特异性结合的功能,免疫活性与亲代抗体 CL-3 相似.结论:本研究获得的以包涵体形式在大肠杆菌中表达的抗人结肠癌单链抗体 CL-3,具有与亲代抗体相似的免疫活性,为高效表达单链抗体,用于肿瘤的诊断和治疗提供了依据.
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帕金森病的发病机制与早期诊断
帕金森病是常见的与衰老有关的神经系统变性疾病,临床上以静止振震颤、运动迟缓、僵直、姿势不稳定为主要症状,其主要病理变化为黑质多巴胺能神经元的大量丢失,在尚存活的神经元中存在嗜酸性细胞内包涵体--Lewy body.
