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日本沼虾酚氧化酶原基因cDNA的全长克隆及表达分析
目的 克隆日本沼虾酚氧化酶原(proPO)基因,进行生物信息学及时空表达分析.方法 利用RT-PCR和快速扩增cDNA末端(RACE)技术从血细胞中克隆proPO基因cDNA全长序列,用生物软件对其序列进行生物信息学分析;proPO基因时空表达分析采用RT-PCR和Real-time PCR方法;腹部肌肉注射嗜水气单胞菌(5.0×109/L)诱导酚氧化酶(PO),20 μl/只,注射后3、6、12、24h取其血淋巴,分别测定血细胞proPO mRNA水平及血清酚氧化酶(PO)活力.结果 日本沼虾proPO基因cDNA全长2428bp,包含71 bp的5'UTR、344 bp的3'UTR和2013bp的开放阅读框(ORF).ORF编码671个氨基酸,预测蛋白分子量为76.5kD,理论等电点(pI)约为7.31;含有2个保守的铜离子结合位点和6个组氨酸残基、1个蛋白酶水解位点和硫酯样的基序(GCGWPRHM);含有3个血蓝蛋白结构域;与罗氏沼虾proPO的相似性高,为93％,与其他甲壳动物proPO相似性为50％～ 53％.该基因表达具有组织特异性,血细胞高,肝胰腺有较弱表达,肌肉、鳃、肠、大颚器官和卵巢不表达;血细胞proPO基因的表达量在蜕皮前期(D0/1)高;嗜水气单胞菌刺激后6h血细胞proPO mRNA水平及血清中PO活力均显著增加.结论 与其他甲壳动物相似,日本沼虾proPO基因具有2个保守的铜离子结合位点;其表达呈组织特异性,高出现在血细胞;在蜕皮周期的前期(D0/1)血细胞表达量高;嗜水气单胞菌可诱导proPO基因的表达以及PO活力,提示该基因是参与机体免疫防御反应的一种重要分子.
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大黄粉虫幼虫体内黑色素合成相关蛋白的鉴定
目的 鉴定大黄粉虫幼虫体内与酚氧化酶(PO)诱导的黑色素合成相关的蛋白(MAPs).方法 体外诱导大黄粉虫幼虫血淋巴中黑色素合成反应,对上清液中的蛋白质进行SDS-PAGE分析,比较黑色素合成前后、合成过程中及在苯硫脲存在下蛋白质的变化,对黑色素合成过程中消失的蛋白进行氨基端氨基酸序列分析.结果 6条蛋白带(MAP-1～6)呈时间依赖性地从黑色素合成反应的上清液中消失,苯硫脲可阻断此反应而取消蛋白的消失;氨基端氨基酸序列分析表明MAP-1,2为已知的大黄粉虫卵黄素样蛋白,MAP-3,4,5为未知蛋白,MAP-6为已知的大黄粉虫干燥蛋白.结论 大黄粉虫幼虫血淋巴中至少5种蛋白与PO诱导的黑色素合成反应特异性相关.
