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人源化小鼠模型研究及应用进展
研究人类复杂疾病的发病机制,筛选有效药物,需要理想的动物模型来进行大量的体内试验.小鼠是应用为广泛的生物模型之一,但考虑到小鼠与人类在生理、病理等诸多方面存在差异,构建具有人类功能性基因、细胞或组织的人源化小鼠模型尤为重要.该文对人源化小鼠模型的研究概况及其在肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病和代谢性疾病等方面的应用进行综述.
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治疗性单克隆抗体研究新进展
治疗性单克隆抗体的快速发展在人类以肿瘤为主的多种疾病的治疗方面发挥至关重要的作用.为了降低鼠源抗体引起的超敏反应,治疗性单克隆抗体已由改型抗体,人源化抗体发展到全人抗体.随着生物技术的不断发展,相信人源化单克隆抗体的前景会越来越广泛.
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多药耐药基因1(Abcb1)敲除和人源化大鼠模型的建立
目的:敲除大鼠多药耐药基因1(Abcb1),并在基因敲除大鼠的基础上建立Abcb1人源化大鼠模型,为Abcb1相关药物代谢和药物评价研究提供更接近人类的动物模型。方法利用大片段转基因技术和CRISPR/Cas9技术相结合,建立人源化大鼠模型,利用PCR,RT-PCR和Real-time PCR的方法进行鉴定及分析。结果将包含人源Abcb1启动子和cDNA的153 kb BAC片断转入到大鼠基因组,获得稳定表达h-Abcb1基因的大鼠,同时建立了Abcb1基因敲除大鼠。通过将两者杂交建立了Abcb1人源化大鼠模型。人源大鼠与大鼠内源Abcb1表达谱有明显的区别,人源化大鼠不仅表达h-Abcb1基因,在组织表达谱方面也与人类更接近。结论建立了Abcb1基因敲除大鼠和人源化大鼠模型,Abcb1人源化模型可作为Abcb1基因相关药物代谢研究更接近人类的动物模型。
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Herceptin及联合顺铂对高表达HER-2/neu卵巢癌体外作用的实验研究及机制探讨
Herceptin是针对HER-2/neu蛋白设计的人源化鼠抗,是一种新型靶向抗肿瘤药物,可明显延长高表达HER-2/neu的晚期乳腺癌患者的生存期.卵巢癌HER-2/neu蛋白的过度表达率为20%~30%[1],与乳腺癌相似.本研究应用Herceptin联合顺铂对高表达HER-2/neu人卵巢癌进行体外作用的实验研究,并对其作用机制进行探讨.
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肿瘤分子靶向治疗进展(四)肿瘤分子靶向治疗在血液系统肿瘤中的应用
5.CD52单抗Campath,化学名阿伦珠单抗(Alemtuzumab),是人源化单抗,识别表达于正常与异常B淋巴细胞的CD52抗原,用以治疗B细胞恶性肿瘤,对NHL有效;对复发性慢性淋巴细胞白血病(CLL),即使对嘌呤类药物无效者,亦可诱导出分子缓解;在无肿块的情况下效果更佳.常见并发症有:低血压(15%),寒颤(89%)、发热(83%)、恶心(22%),呕吐(33%),气短,支气管痉挛,皮疹(30%),疲乏(22%),呼吸困难(17%),头痛(13%),腹泻(13%),感染(12%).
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抗前列腺癌γ-精浆蛋白人源Fab抗体的原核表达和特性鉴定
目的:对从噬菌体抗体库筛选的抗γ-精浆蛋白(γ-sm)人源化Fab抗体进行表达纯化和生物学特性鉴定,为其应用于前列腺癌抗体导向酶-前药治疗奠定基础.方法:首先将重组表达载体γ-sm-hFab/pComb3X转化大肠杆菌并诱导其可溶性表达,亲和纯化后采取Western-blot检测表达产物对γ-sm抗原结合特异性.其次分别采用抑制ELISA和竞争抑制ELISA方法分析表达纯化的抗γ-sm人源Fab抗体的亲和力和结合表位.后采用竞争抑制流式细胞术和免疫组化超敏S-P法鉴定制备纯化的人源Fab抗体在前列腺癌细胞和组织上的结合分布特性.结果:成功诱导表达和纯化出理论分子量大小可溶性Fab抗体蛋白,含量约占细菌总可溶性蛋白的20.5%,Western-blot证实其能特异性结合识别γ-sm.抑制ELISA显示其表观结合常数(Ka)为0.78×108 M-1,亲和力约为亲本鼠源单抗E4B7的37.5%,竞争抑制ELISA进一步显示,二者识别γ-Sm抗原蛋白上的表位相同.流式细胞术和免疫组化显示,表达纯化的人源Fab抗体可显著地与前列腺癌细胞和组织特异性结合,其结合主要分布在腺上皮内瘤和中低度恶性的前列腺癌组织上.结论:成功地对筛选的抗γ-sm人源Fab抗体进行了原核可溶性表达、纯化和免疫生物学特性鉴定,为其进一步应用于抗体导向酶-前药实验治疗前列腺癌奠定了基础.
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IgE拮抗剂治疗中重度哮喘
免疫球蛋白IgE在速发型变态反应中的作用早已获得公认.近些年来,人们对IgE拮抗剂进行深入研究.奥莫立迈(Omalizumab,商品名XolairTM)随之问世.这是一种人源化的抗IgE单克隆抗体,2003年6月正式通过FDA认证,现已在国外成功上市.大量研究显示,奥莫立迈是有效治疗哮喘的一项新策略.现对有关的研究进展进行综述.
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中重度银屑病患者使用依法利珠单抗可诱发银屑病关节炎
法国圣路易斯医院的Viguier等通过同顾性研究发现,治疗银屑病的重组人源化嵌合抗CD11a单克隆抗体--依法利珠单抗可诱发银屑病关节炎的发生.
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赛尼哌预防肾移植术后急性排斥反应的临床观察
目的观察人源化的抗IL-2R单克隆抗体赛尼哌预防肾移植术后急性排斥反应的疗效.方法 65例肾移植受者分为两组,赛尼哌组22例,对照组43例.两组均采用环孢素A+骁悉+肾上腺皮质激素的三联免疫抑制方案.赛尼哌组在此基础上在术前1 h和术后15 d分别给赛尼哌50 mg.观察术后3个月内急性排斥反应发生情况、肾功能恢复情况、不良反应及感染发生情况.结果赛尼哌组急性排斥反应发生率为4.5%,对照组为16.2%.两组比较有显著性差异(P<0.05).在不良反应和感染方面,两组无显著差异.结论赛尼哌可以显著减少肾移植后急性排斥反应发生率,同时并不增加感染和其他不良反应.
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一个靶点成就一个产业
2007年新年伊始,我国第一个自动化大规模哺乳动物细胞培养技术平台全线贯通,它的诞生立即汇聚了中国医药界关注的目光.该平台率先实现了我国首个人源化单抗药物泰欣生TM(尼妥珠单抗,Nimotuzumab)的产业化生产,大大缩短了我国与发达国家在抗体药物产业化进程中的差距.
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B细胞表位人源化的猪ZP4在大肠杆菌中的表达与鉴定
近年来,以卵透明带为靶抗原的疫苗制备已从初的卵透明带及其组分水平向更高层次发展.Minoru等[1]发现用人工合成的LDPENLTL八肽B细胞表位片段与外源性T细胞表位所得嵌合肽免疫小鼠所得抗血清可有效抑制猪精卵结合试验,但对人精卵结合试验却效果甚差.
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HBV小鼠模型与肝脏免疫学研究进展
乙型肝炎病毒( Hepatitis B virus, HBV)严重威胁人类健康,免疫紊乱是主要病理学机制。由于HBV不能自然感染小鼠,研究者试图创建 HBV小鼠模型,以模拟HBV的免疫病理学过程。本文将介绍各种HBV小鼠模型的构建方法,包括HBV转基因技术、HBV病毒活体肝脏靶向转染技术以及HBV自然感染人源化小鼠技术等,同时还分析了各HBV小鼠模型的优缺点、利用这些模型所解决的一系列免疫学问题,以及该领域的发展展望。
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抗人纤维蛋白单链抗体的人源化
目的:人源化抗人纤维蛋白单链抗体,降低人抗鼠抗体反应.方法:从人免疫球蛋白基因数据库中挑选到与鼠源抗人纤维蛋白单链抗体scFv-8E5重链(VH-8E5)和轻链(VL-8E5)同源性高的序列,作为人源化改造的框架,其中植入scFv-8E5的互补决定区.人工合成其DNA片段,用DNA连接酶连接成完整的人源化VH-8E5和VL-8E5,构建表达载体,转化JM109后用IPTG诱导表达,ELISA测定其抗原结合活性.结果:表达产物分子量30 kD左右,人源化scFv-8E5与亲本抗体scFv-8E5抗原结合活性无明显差别,可耐受至少2 w,4℃保存,数次反复冰融或一定时间的37℃孵育.结论:人源化scFv-8E5具有特异性识别人纤维蛋白的活性,鼠源scFv-8E5的人源化基本获得成功.
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基于同源模建技术的抗肝癌单链抗体人源化抗体库设计
目的:完成抗肝癌噬菌体单链抗体scFv DM的人源化设计,为进一步构建人源化抗肝癌噬菌体单链抗体库奠定基础。方法通过IgBlast搜索基因数据库获取鼠源抗体序列模板,从蛋白质晶体结构数据库获得结构模板;在 SGI图形工作站上,通过 InsightlⅡ软件包进行抗肝癌噬菌体单链抗体scFv DM的三维结构模建,分析抗体氨基酸序列和分子结构,确定影响抗原结合部位的框架区关键残基。结果成功模建抗肝癌噬菌体单链抗体scFv DM的三维结构,确定AAW67378、BAB18257分别为单链抗体scFv DM的重链和轻链框架区佳人源化模板,确定了人源化残基、回复突变的残基,将可能影响抗原结合位点结构的残基的鼠源和人源副本编入到人源化抗体库序列中。结论计算机辅助下的同源模建技术可为抗体人源化设计提供方案,为抗肝癌噬菌体单链抗体scFv DM同步实现人源化和优化提供可能性。
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抗体人源化技术研究进展
人源化单克隆抗体已日益广泛地应用于治疗以肿瘤为主的多种疾病.重组DNA技术使鼠源抗体的人源化改造得以实现.此文对抗体人源化技术的发展及面临的问题进行综述.
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Natalizumab诱导Crohn病缓解
背景:Crohn病的发病机理与白细胞移行至肠组织中引起炎症有关.natalizumab是重组人源化IgG4单克隆抗体,能通过与α4整联蛋白(integrin)结合,阻止白细胞黏附和移行到肠道中.动物研究的结果提示,阻断α4整联蛋白的作用可有效治疗炎症性肠病.随机对照试验结果提示,natalizumab可有效治疗活动性Crohn病.本系统评论摘述了当前应用natalizumab诱导Crohn病缓解的证据.
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全人源单克隆抗体现状及发展趋势
单克隆抗体(单抗)是继疫苗、重组蛋白后重要的一类生物技术产品,是21世纪生物技术和生物医药产业领域的战略制高点.单抗已成功应用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反应等.单抗技术经过35年的发展,历经鼠源性(murine)、嵌合(chimeric)、人源化(humanized)和全人源单抗(human monoclonal antibody)四个阶段[1-2].
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抗CD20人源化抗体的制备及生物学活性鉴定
在前期实验中,我们制备了一株抗CD20的嵌合抗体c8F6并证实其可有效杀伤CD20阳性的B淋巴瘤细胞.为了进一步降低c8F6的免疫原性,在研究中我们采用同源模建的方法模拟8F6的三维结构,通过分析其空间结构,确定可能影响抗体与抗原结合的框架区(FR)氨基酸残基,然后将鼠源抗体互补决定区(CDR)和FR区的关键氨摹酸移植到人源模板上,构建出人源化抗体hu8F6.此人源化抗体除cDR区外,仅含有11个鼠源残基,但具有与嵌合抗体相似的亲和力和特异性.体外生物学功能实验进一步表明,hu8F6具有与c8F6相似的补体依赖的细胞溶解作用(CDC)和抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC),可有效杀伤人B淋巴瘤细胞Raji和Daudi,提示hu8F6有望发展成为一个用于B淋巴瘤治疗的低免疫原性抗体制剂.
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Pembrolizumab对1例晚期非小细胞肺癌伴腹水的治疗报告
非小细胞肺癌(non‐small cell lung cancer , NSCLC)占肺癌的80%~90%[1]。以铂类药物为主的化疗仅对的30%的 NSCLC患者有效[2],还有部分患者不能耐受。 Pembrolizumab是一种新型人源化单抗,其通过干扰程序性细胞死亡分子1(programmed death 1, PD‐1)提升人体免疫力,主要用于治疗接受 ipilimumab(伊匹单抗)治疗后不可切除的或转移性黑素瘤,近年来在肺癌、肾癌等肿瘤中取得了较好的疗效。本研究观察了 pembrolizumab对1例晚期 NSCLC 伴腹水患者的疗效,现报告如下。
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抗γ-精浆蛋白人-鼠杂合Fab噬菌体抗体库的构建及导向筛选
目的:建立人-鼠杂合Fab噬菌体抗体库,筛选抗γ-精浆蛋白(γ-sm)人源性抗体轻链.方法:PCR扩增前列腺癌患者外周血淋巴细胞人抗体全套轻链基因,克隆入含鼠源抗γ-sm抗体Fd基因的pComb3X噬粒中,建立人-鼠杂合Fab噬菌体抗体库.通过稀释滴定、限制性酶切等分别对库容、基因重组率和多样性进行鉴定.以M13K07辅助噬菌体超感染,利用纯化的γ-sm对杂合库进行筛选,对筛出的阳性克隆进行功能检测.结果:构建了库容量为1.2×107CFU、重组率为90%、多样性好的人-鼠杂合噬菌体抗体库.ELISA检测出2个强阳性克隆,Western blot确证为抗γ-sm的人-鼠杂合Fab,竞争ELISA显示其表观亲和力约为亲本鼠抗体亲和力的71.8%.DNA测序显示筛到的人源轻链可变区基因属IGKV4-1*01胚系家族.结论:成功得到人源性抗γ-sm抗体轻链,为进一步获得全人源化抗体奠定了基础.