首页 > 文献资料
-
抗γ-精浆蛋白人-鼠杂合Fab噬菌体抗体库的构建及导向筛选
目的:建立人-鼠杂合Fab噬菌体抗体库,筛选抗γ-精浆蛋白(γ-sm)人源性抗体轻链.方法:PCR扩增前列腺癌患者外周血淋巴细胞人抗体全套轻链基因,克隆入含鼠源抗γ-sm抗体Fd基因的pComb3X噬粒中,建立人-鼠杂合Fab噬菌体抗体库.通过稀释滴定、限制性酶切等分别对库容、基因重组率和多样性进行鉴定.以M13K07辅助噬菌体超感染,利用纯化的γ-sm对杂合库进行筛选,对筛出的阳性克隆进行功能检测.结果:构建了库容量为1.2×107CFU、重组率为90%、多样性好的人-鼠杂合噬菌体抗体库.ELISA检测出2个强阳性克隆,Western blot确证为抗γ-sm的人-鼠杂合Fab,竞争ELISA显示其表观亲和力约为亲本鼠抗体亲和力的71.8%.DNA测序显示筛到的人源轻链可变区基因属IGKV4-1*01胚系家族.结论:成功得到人源性抗γ-sm抗体轻链,为进一步获得全人源化抗体奠定了基础.
-
嵌合轻链为模板导向筛选人源性抗肝癌抗体重链Fd片段
目的:利用噬菌体抗体库和导向选择技术,以抗HAb18G嵌合抗体轻链为模板,筛选人源性抗肝癌抗体Fd片段.方法:利用RT-PCR自肝癌患者外周血淋巴细胞中扩增全套人抗体重链Fd基因片段,克隆入含嵌合L链的展示载体pComb3X,建立人-鼠杂合Fab噬菌体抗体库.然后,利用大肠杆菌表达的非融合HAb18GE为抗原进行亲和筛选,利用pⅢ融合抗体的形式进行克隆鉴定,并对筛选出的杂合抗体进行初步的功能检测.结果:构建成功库容量为2×107PFU的杂合人-鼠噬菌体抗体库,利用非融合表达的HAb18GE进行6轮筛选.ELISA及流式细胞仪检测,其中7个克隆呈特异性阳性反应.其中克隆AP6-2和AP6-7亲和力较高,测序显示其基因序列相同,且与亲本抗体恒定区序列相同,属IgG2亚类,可变区属VH3家族.结论:通过本实验,利用嵌合轻链为模板,进行Fd片段替换,成功筛选到人源性抗体Fd片段.
-
以鼠源重链Fd片段为模板导向筛选人源性抗γ-精浆蛋白抗体轻链
目的: 以鼠源抗γ-sm抗体重链Fd片段为模板, 筛选人源性抗人γ-精浆蛋白抗体轻链.方法: 利用RT-PCR从前列腺癌患者外周血淋巴细胞扩增出全套的人抗体轻链基因, 克隆入含鼠源性抗γ-sm抗体重链Fd片段的噬粒载体pComb3X/mFd中, 电转化大肠杆菌XL1-Blue后建立人-鼠杂合的Fab抗体库.通过稀释滴定、限制性酶切和随机测序, 对所建杂合库的库容、重组率和多样性分别进行鉴定, 以M13K07辅助噬菌体超感染, 利用亲和纯化的γ-sm为抗原, 对挽救展示的噬菌体抗体库进行3轮淘筛和克隆鉴定.后对筛选出的杂合抗体进行初步的功能检测.结果: 构建成功1.2×107CFU、重组率为90%、多样性好的杂合人-鼠噬菌体抗体库.利用纯化的γ-sm 3轮亲和淘筛后, 5个克隆成功诱导表达特异性的pIII融合抗体.ELISA进一步检测表明, 5个克隆均呈特异性阳性反应, 其中2个克隆亲和力较高, 测序显示其所含轻链基因序列完全相同, 可变区来源于IGKV4-1*01胚系基因家族.结论: 利用鼠源Fd片段为模板, 导向筛选杂合噬菌体库, 成功筛选到人源性抗人γ-精浆蛋白抗体轻链.
