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多药耐药基因1（Abcb1）敲除和人源化大鼠模型的建立
目的：敲除大鼠多药耐药基因1（Abcb1），并在基因敲除大鼠的基础上建立Abcb1人源化大鼠模型，为Abcb1相关药物代谢和药物评价研究提供更接近人类的动物模型。方法利用大片段转基因技术和CRISPR／Cas9技术相结合，建立人源化大鼠模型，利用PCR，RT-PCR和Real-time PCR的方法进行鉴定及分析。结果将包含人源Abcb1启动子和cDNA的153 kb BAC片断转入到大鼠基因组，获得稳定表达h-Abcb1基因的大鼠，同时建立了Abcb1基因敲除大鼠。通过将两者杂交建立了Abcb1人源化大鼠模型。人源大鼠与大鼠内源Abcb1表达谱有明显的区别，人源化大鼠不仅表达h-Abcb1基因，在组织表达谱方面也与人类更接近。结论建立了Abcb1基因敲除大鼠和人源化大鼠模型，Abcb1人源化模型可作为Abcb1基因相关药物代谢研究更接近人类的动物模型。
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利用TALENs技术制备瘦素基因敲除的大鼠
目的 瘦素(leptin)是一种调节机体摄食和能量代谢的细胞因子,也参与神经细胞发育、免疫、糖脂代谢等,由于大鼠在代谢和神经研究等方面的优点,研制leptin基因敲除大鼠(leptin-/-),为这几方面的深入研究提供模型.方法 利用类转录激活因子效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)技术,制备leptin-/-大鼠.利用称量方法测定不同时间点的体重变化,利用磁共振成像观测大鼠脂肪积累及分布,利用病理学方法观察胰腺的病理变化,并进行血生化、腹腔糖耐受实验及葡萄糖刺激下的血清胰岛素含量测定.结果 获得一个在leptin基因编码区418～425位有8个碱基缺失的首建鼠,由于产生了TGA终止密码子,使该蛋白C末端缺失了28个氨基酸.Leptin-/-大鼠从5周龄开始出现显著的体重增加,到4月龄时体重比野生SD大鼠(leptin+/+)增加了52％.2月龄MRI结果显示leptin-/-大鼠与leptin+/+大鼠相比,在腹腔和皮下均有更多的脂肪积累,同时病理观察也发现leptin-/-大鼠胰腺中胰岛细胞显著增生.4月龄时,leptin-/-大鼠的血清中甘油三酯和胆固醇含量分别是leptin+/+大鼠的8.4倍和1.8倍,同时出现了明显的糖耐受受损和高胰岛素血症.结论 利用TALENs技术成功建立了瘦素基因敲除大鼠,并表现出明显的肥胖、高胰岛素血、高脂血和糖代谢异常.结果表明:该敲除大鼠可作为代谢、神经、免疫等研究的潜在模型.
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利用CRISPR/Cas9技术构建FARS2基因定点突变的大鼠模型
目的:利用CRISPR/Cas9技术构建FARS2基因特定位点突变的大鼠模型.方法:根据FARS2基因序列,设计FARS2基因特异性的单链向导RNA(sgRNA)引物序列并克隆入pU57-T7-GDNA载体.利用T7RNA聚合酶体外转录sgRNA和Cas9 mRNA.将体外转录的sgRNA/Cas9 mRNA显微注射入SD大鼠受精卵,通过PCR和基因测序对FARS2基因特定位点突变进行检测和鉴定.繁育FARS2基因敲除大鼠并分析后代突变情况.结果:基因测序证实成功构建表达sgRNA载体,成功将sgRNA和Cas9 mRNA直接注射人大鼠受精卵.基因测序鉴定获得5只F0代初建鼠.DNA测序结果证实5号大鼠(ID#5)发生了gac＞ tac突变,该突变并可遗传至子代大鼠.结论:利用CRISPR/Cas9技术成功制备FARS2基因定点突变的大鼠模型,为进一步研究FARS2的功能奠定了基础.
关键词： CRISPR/Cas9 FARS2 sgRNA 遗传性痉挛性截瘫 基因敲除大鼠
