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低氧对RAW264.7细胞中糖皮质激素受体表达的调节
目的 观察小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞在低氧培养箱(1% O2)内不同时间段糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)mRNA和蛋白表达的变化,探讨低氧对RAW264.7细胞中GR表达的调节.方法 采用体外培养的小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞,将细胞接种于60 mm dish内,细胞长至50%时,将培养液置换为含5%无激素胎牛血清的无糖DMEM培养液,放入低氧培养箱内,同时输入含1% O2、5% CO2、94% N2 的混合气体,分别于低氧处理4、8、12 h后将细胞取出,抽提RNA或者蛋白,应用real-timePCR 和Western印迹分析测定GRmRNA和蛋白的表达水平,以未低氧处理RAW264.7细胞为对照.结果 低氧处理4 h可使RAW264.7细胞中GR mRNA的表达明显上调为对照的1.8倍(P<0.05),处理至12 h GRmRNA的表达仍高于对照,约为对照的2.7倍(P<0.05);低氧处理RAW264.7细胞8 h GR蛋白的表达也明显升高,约为对照的1.7倍(P<0.05),至低氧处理12 h,GR蛋白的表达仍高于对照.结论 低氧可以上调体外RAW 264.7细胞GR mRNA和蛋白的表达.
关键词： 低氧 糖皮质激素受体 RAW264.7细胞 地塞米松 -
补益肝肾对类风湿关节炎患者糖皮质激素受体的影响
目的:研究补益肝肾治疗类风湿关节炎(RA)疼痛对糖皮质激素受体的影响.方法:补益肝肾治疗RA疼痛患者,检测78例RA患者治疗前后及72例健康人血中GR的含量.结果:RA患者疼痛缓解,治疗前GR含量明显高于正常对照组,治疗后与正常对照组差异无显著性.结论:补益肝肾可有效缓解RA疼痛,通过影响GC受体发挥抗炎镇痛作用.
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淫羊藿及女贞子协同布地奈德对哮喘大鼠糖皮质激素受体及抗炎作用的影响
目的 研究淫羊藿、女贞子协同布地奈德对哮喘大鼠糖皮质激素受体(GR)及抗炎作用的影响.方法 SPF级健康雄性SD大鼠,随机分为正常对照组、哮喘模型组、布地奈德组(0.01％布地奈德雾化20 min)、煎剂组(淫羊藿、女贞子煎剂3.5 g/kg灌胃)、布地奈德合煎剂组(0.01％布地奈德雾化20 min+淫羊藿、女贞子煎剂3.5 g/kg灌胃).采用酶免法检测血清皮质酮(CORT)、白介素-4(IL-4)、免疫球蛋白E(IgE)含量,流式细胞术检测肺泡灌洗液(BALF)中GR蛋白表达及结合力.结果 布地奈德组及布地奈德合煎剂组可显著降低血清IL-4、IgE含量(P＜0.05,P＜0.01);煎剂组能显著降低血清IgE含量(P＜0.05)、升高血清CORT、BALF GR蛋白含量(P＜0.05);布地奈德合煎剂组能显著升高血清CORT含量、BALF GR蛋白含量及蛋白结合力(P＜0.01,P＜0.05).结论 保护糖皮质激素(GC)发挥作用的环节及局部抗炎作用的敏感性可能是淫羊藿、女贞子协同布地奈德治疗哮喘的作用机制之一.
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213中药对糖皮质激素受体影响的研究进展
对近年来有关常用中药对糖皮质激素受体(GR)的调节作用的文献资料加以综合归纳,以明确其发挥作用的有效成分及其作用机理,为中药的临床应用奠定基础.
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鼻渊舒口服液对慢性鼻-鼻窦炎模型鼻窦黏膜上皮GR及IκBα表达的影响
观察鼻渊舒口服液对慢性鼻原鼻窦炎（CRS）模型鼻窦黏膜上皮糖皮质激素受体（GR）及核因子资B抑制蛋白（I资Bα）表达的影响，从抑炎机制角度，探索鼻渊舒对CRS的治疗机制。方法：选取新西兰大白兔100只，按每组20只，随机分为正常组、假手术组、模型组、鼻渊舒组、克拉霉素组后，建立CRS模型，正常组、假手术组、模型组不干预，鼻渊舒、克拉霉素组分别给予鼻渊舒（1.5 mL·kg-1·d-1）、克拉霉素（25 mg·kg-1·d-1）灌胃14天，治疗结束后取鼻窦黏膜，HE染色观察其病理改变，Western Blotting法检测鼻窦黏膜上皮细胞胞浆糖皮质激素受体（GR）及核因子资B抑制蛋白（I资Bα）蛋白表达。结果：模型组鼻窦黏膜炎细胞明显浸润，呈慢性炎症病变，腺体及杯状细胞明显增生；与正常组比较，GR表达显著降低（P约0.01），I资Bα表达显著增高（P约0.01）。鼻渊舒灌胃治疗后，鼻窦黏膜上皮得到较好修复，炎细胞浸润不明显，腺体和杯状细胞增生亦不明显；与模型组比较，GR表达显著增高（P约0.01），I资Bα表达显著降低（P约0.01）。结论：鼻渊舒在促进抑炎途径的GR表达的同时，通过抑制I资Bα表达，防止I资Bα对NF-资B促炎途径的过度抑制，动态调控了鼻窦黏膜上皮炎症的平衡。
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糖皮质激素受体介导下栀子苷对LPS诱导的脓毒症小鼠的保护作用
目的 研究栀子苷对脂多糖(LPS)诱导的脓毒症模型鼠的保护作用与糖皮质激素受体间的关系.方法 50 mg/kg LPS诱导C57BL/6 J小鼠脓毒症模型,观察栀子苷20mg/kg和40mg/kg两个剂量对模型鼠的影响.通过检测小鼠肛门温度、体重和肺组织病理变化(HE染色法)观察栀子苷对LPS诱导的脓毒症小鼠的保护作用.通过检测小鼠血清中糖皮质激素皮质醇含量[酶联免疫吸附法(ELISA)]的变化和糖皮质激素受体下游基因的表达变化(荧光定量PCR法)探讨栀子苷对脓毒症小鼠保护作用的作用机制.结果 栀子苷能够明显改善LPS诱导的模型鼠的肛门温度(P＜0.05)和体重(P＜0.01)的下降趋势;栀子苷能明显改善LPS诱导的肺组织病理状态;LPS诱导的模型鼠血清皮质醇含量增加(P＜0.05),栀子苷作用后能够显著降低皮质醇含量(P＜0.01);栀子苷两个剂量组不同程度的降低糖皮质激素受体下游基因IL-10、Edn1 、Tnf的表达(P＜0.05).结论 栀子苷通过糖皮质激素受体对LPS诱导的脓毒症小鼠具有保护作用,能够改善脓毒症小鼠皮质醇异常增高现象,调节糖皮质激素下游基因的表达变化.
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电针对类风湿关节炎大鼠糖皮质激素及受体的影响
目的:探讨电针对类风湿性关节炎(RA)大鼠糖皮质激素(CS)及受体(GCR)的影响.方法:采用佐剂性关节炎大鼠(AA)作为RA动物模型,电针"足三里"治疗后,放免测定血浆CS、胸腺GCR含量.结果:模型组大鼠血浆CS明显下降,电针后CS水平明显升高,二者比较,P＜0.05,且达到正常水平,电针组与正常组比较,P＞0.05;模型组大鼠胸腺GCR KD值显著低于正常组和空电组(P＜0.01),其浓度也明显低于正常组、空电组(P＜0.05),电针治疗后GCR KD值和浓度水平与模型组相比均有显著提高(P＜0.01).结论:电针能够增加RA大鼠的CS、GCR含量水平.
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电针对创伤后应激障碍大鼠行为学和海马糖皮质激素受体表达的影响
目的:观察电针对创伤后应激障碍(PTSD)模型大鼠的治疗作用并探讨其可能的作用机制,为临床针灸治疗PTSD提供依据.方法:SD大鼠随机分为正常组、模型组和电针组,每组10只.采用国际上公认的单程长时应激方法制作PTSD模型.电针组大鼠给予“百会”与“足三里”2 Hz电针刺激,30 min/次,每日治疗1次,连续1周.通过Morris水迷宫实验观察3组大鼠的学习记忆能力；采用免疫组织化学方法检测糖皮质激素受体(GR)和盐皮质激素受体(MR)在各组大鼠海马的表达.结果:模型大鼠的逃避潜伏期明显延长,电针治疗能显著缩短PTSD模型大鼠的逃避潜伏期(均P＜0.05)；模型组大鼠海马GR表达明显高于正常组,电针组大鼠海马GR表达显著低于模型组(均P＜0.05)；模型组大鼠海马MR表达明显低于正常组,电针组大鼠海马MR表达显著高于模型组(均P＜0.05).结论:电针改善PTSD模型大鼠空间学习记忆能力可能与电针影响其海马MR和GR的表达有关.
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柴胡加龙骨牡蛎汤对创伤后应激障碍的疗效及机制研究
目的:柴胡加龙骨牡蛎汤(TJ-12)对创伤后应激障碍的疗效及机制.方法:应用ICR小鼠与EL小鼠建立社会失败应激模型,随机分为5组,即模型组及正常对照组、模型+柴胡加龙骨牡蛎汤高、中、低剂量组(1,0.5,0.1g·kg-1),ig给药,每天1次,连续给药4周.观察条件性恐惧行为,同时用实时RT-PCR法测小鼠海马糖皮质激素受体(GR)及脑神经源性营养因子(BDNF)的基因表达.结果:与正常对照组比较,模型组小鼠出现“僵直”时间百分比延长、海马基因GR与BDNF表达增加,有非常显著性差异.与模型组比较,TJ-12治疗组不仅可以缩短“僵直”时间百分比,且能降低海马BDNF基因的表达,有显著性差异.结论:TJ-12有效治疗创伤后应激障碍可能与调节海马BDNF基因相关.
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生脉散饮片配伍与组分配伍对热损伤大鼠糖皮质激素受体的作用比较
目的:观察生脉散组分配伍与饮片配伍对热损伤大鼠糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)作用的差异.方法:雄性SD大鼠32只,随机分为4组:空白对照组、模型组、生脉散组分配伍组和生脉散饮片组,每组8只.连续给药1周后除空白对照组外,其余3组大鼠复制热损伤模型,随后立即断头处死动物,收集血清,酶联免疫法检测血清皮质酮(corticosterone,CS)浓度,放射免疫法检测血清促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic lhormone,ACTH)的浓度;放射配基法检测肝、肺、肾细胞液GR结合容量,结果采用单点分析.结果:热损伤后,大鼠肝、肺、肾细胞液GR结合容量明显低于空白对照组(P<0.01),而生脉散组分配伍组及生脉散饮片组肝、肺GR结合容量均高于模型组;生脉散组分配伍组肝脏GR结合容量高于生脉散饮片组(P<0.01),但肺、肾GR结合容量两组之间差异无统计学意义.模型组、生脉散饮片组及生脉散组分配伍组CS、ACTH水平较正常对照组明显升高(P<0.01),但3组间差异均无统计学意义.结论:生脉散组分配伍上调热损伤大鼠GR的效果略优于饮片配伍.
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左归丸和右归丸对老年大鼠海马GRmRNA表达与HPA轴活性的影响
目的:观察左归丸和右归丸对老年大鼠海马糖皮质激素受体(GR)mRNA表达和下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴活性的影响,探索GRmRNA表达和HPA轴活性的关系.方法:以自然衰老SD雄性大鼠(24月龄)为肾虚衰老模型,大鼠随机分为老年对照组、左归丸组和右归丸组,每组35只,另设青年对照组(5月龄)35只,共4组.老年对照组大鼠常规喂养至24月龄.左、右归丸组大鼠自20月龄始,均按相当于左、右归丸生药7.5 g·kg-1(成人临床用量的15倍)自由饮用稀释药液,每周停药2天,连续4个月;采用原位杂交法检测大鼠海马组织GRmRNA表达,放免法检测大鼠血浆皮质酮(CORT)含量.结果:与青年对照组相比,老年对照组大鼠海马CA1区GRmRNA表达水平均显著下降(P<0.05),血浆CORT含量显著增高(P<0.05);与老年对照组比较,左归丸组和右归丸组大鼠海马CA1区GRmRNA表达水平显著升高(P<0.05),血浆CORT含量显著降低(P<0.05).结论:左归丸和右归丸可能通过上调自然衰老SD雄性大鼠海马GRmRNA表达,加强对HPA轴的抑制作用,进而降低血浆CORT含量.
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抑郁症与HPA轴关系及中药干预的研究进展
介绍了抑郁症与肾上腺轴的关系以及中药干预相关机制的新研究资料.查阅CNKI数据库相关文献39篇.研究表明抑郁症患者血浆中促肾上腺皮质激素释放激素、促肾上腺皮质激素、糖皮质激素浓度升高,一方面糖皮质激素的持续升高使海马中糖皮质激素受体数量减少、盐皮质激素受体/糖皮质激素受体比例失衡,进而破坏海马神经元;另一方面,海马本身能抑制下丘脑-垂体-肾上腺轴的活性,海马神经元的破坏使抑制下丘脑-垂体-肾上腺轴的作用减弱;同时糖皮质激素的升高,使糖皮质激素受体的数量和功能降低,造成糖皮质激素对下丘脑-垂体-肾上腺轴负反馈抑制作用减弱,使其功能更为亢进,形成恶性循环.认为中医药具有多靶点、多层面、多轴点的作用特征,通过对HPA轴来干预抑郁症具有一定的现实意义.
关键词： 抑郁症 下丘脑-垂体-肾上腺轴 糖皮质激素受体 盐皮质激素受体 -
补肾方药对老年大鼠BDNF介导的信号通路关键分子表达的影响
目的:观察左归丸、右归丸对老年大鼠学习记忆相关信号分子脑源性神经营养因子(BDNF)、酪氨酸蛋白激酶B(TrkB)、细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)、反应结合蛋白(CREB)、活性调节细胞骨架蛋白(Arc)及突触蛋白(Synapsin) mRNA表达的影响.方法:以自然衰老SD雄性大鼠为动物模型,随机分为老年对照组、老年糖皮质激素拮抗组、老年左归组和老年右归组,另设青年对照组.采用原位杂交法检测海马各分区TrkB mRNA表达变化,实时定量PCR法观察海马组织BDNF、ERK1/2、CREB、Arc及Synapsin mRNA表达变化.结果:与青年对照组比较,老年大鼠海马上述分子mRNA表达均明显降低(P＜0.05);与老年对照组比较,RU38486能明显上调老年大鼠海马CA1区TrkB mRNA表达,提高海马组织ERK1/2、Arc及Synapsin mRNA表达(P＜0.05);左归丸及右归丸均能明显上调老年大鼠海马CA1、CA2-3分区TrkB mRNA表达(P＜0.05),同时左归丸还能显著提高老年大鼠海马组织Arc及Synapsin mRNA表达(P＜0.05).3种药物对其余信号分子的表达均存在一定的上调作用,但无统计学差异.结论:左归丸、右归丸及RU38486可能通过改善学习记忆相关信号分子的异常表达,进而提高长时程增强效应和延缓老年大鼠学习记忆能力的退化.
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难治性肾病综合征糖皮质激素受体及HSP90与中医证型的相关性研究
目的:探讨难治性肾病综合征(RNS)糖皮质激素受体α、β(GRα、GRβ)、热休克蛋白90(HSP90)的表达及其与中医证型的相关性.方法:选择原发性肾病综合征(PNS)患者80例,其中激素敏感组(SSNS)25例、RNS组55例,另设健康对照组15名,应用免疫细胞化学法检测外周血单个核细胞(PBMC)GRα、GRβ表达,流式细胞术测定HSP90含量,分析各组GRαt、GR β、HSP90的表达与激素敏感性的关系;进而将RNS组按辨证标准分为脾肾阳虚证21例,气阴两虚证19例,湿热证15例,分析上述指标与中医证型的相关性.结果:①与健康对照组比较,PNS组GRα显著下降(P＜0.05),GR β、HSP90均显著升高(P＜0.01,P＜0.05);②RNS组GRβ、HSP90高于SSNS组(P＜0.01,P＜0.05),GR α/GR β低于SSNS组(P.＜0.05);③RNS三个中医证型组中,GRα表达无显著性差异;GRβ的表达呈脾肾阳虚证＜气阴两虚证＜湿热证(P＜0.05);GRα/GR β呈脾肾阳虚证＞气阴两虚证＞湿热证(P＜0.05);3组中HSP90以湿热证组高(P＜0.05),气阴两虚证组、脾肾阳虚证组无显著性差异.结论:GRβ及HSP90参与了RNS的发生与发展;湿热证者易发展为RNS,气阴两虚证者次之.
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基于HSP90-GR作用研究淫羊藿和女贞子对激素局部干预哮喘大鼠的影响
目的:研究淫羊藿和女贞子配伍对激素局部干预哮喘大鼠肺热休克蛋白90(HSP90)、糖皮质激素受体(GR)的影响作用.方法:SPF级雄性SD大鼠,随机分为正常对照组(N组)、哮喘模型组(A组)、布地奈德组(GC组),淫羊藿女贞子组(YN组),淫羊藿女贞子合布地奈德组(YN+GC组).卵蛋白致敏及激发建立大鼠哮喘模型,YN+GC组以布地奈德雾化4周治疗,同时配合灌胃淫羊藿女贞子煎液;GC组、YN组分别单用相应药物治疗.免疫细胞化学检测肺泡灌洗液(BALF)中HSP90蛋白表达,免疫组织化学法检测肺组织HSP90蛋白表达,实时定量PCR法检测肺组织HSP90及GR的mRNA表达.结果:与N组比较,A组大鼠肺组织HSP90蛋白、GR αmRNA及GR α/HSP90mRNA比值显著降低(P＜0.01,P＜0.05);与A组比较,YN组显著上调肺GR α mRNA表达(P＜0.01),YN+GC组上调肺HSP90蛋白及mRNA与GRα mRNA表达(P＜0.05,P＜0.01);与GC组比较,YN+GC组可显著上调BALF及肺组织中HSP90蛋白表达,肺HSP90及GR α mRNA表达及GR α/HSP90mRNA比值(P＜0.05,P＜0.01).结论:改善GR-HSP90作用可能是平补阴阳药对淫羊藿和女贞子协同激素局部给药发挥作用的机制之一.
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隔药饼灸对功能性消化不良肝郁脾虚模型大鼠HPA轴中枢相关受体及激素的影响
目的:观察隔药饼灸对功能性消化不良(FD)肝郁脾虚模型大鼠HPA轴中枢相关受体及激素的影响,探讨隔药饼灸治疗FD可能的作用机制.方法:将SD大鼠随机分为空白(A)组、模型(B)组、隔药饼灸(C)组、艾炷灸(D)组和逍遥散(E)组,每组10只,除A组外,其余4组采用复合病因造模法造模,连续3周;再按被试因素施加方法,分别进行隔药饼灸、艾炷灸和逍遥散灌胃治疗14d;实验结束后采用RT-PCR检测下丘脑、垂体糖皮质激素受体(GR) mRNA表达,ELISA检测下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、垂体促肾上腺皮质激素(ACTH)及肾上腺皮质酮(CORT)的含量.结果:与A组比较,B组大鼠GR mRNA在下丘脑及垂体的表达显著下降(P＜O.01),且下丘脑CRH、垂体ACTH、肾上腺CORT含量显著上升(P＜0.01);与B组比较,C、D、E组治疗组大鼠GR mRNA在下丘脑及垂体的表达显著上升(P＜0.01),且下丘脑CRH、垂体ACTH、肾上腺CORT含量均显著下降(P＜0.01);与E组比较,C组大鼠GR mRNA在下丘脑及垂体的表达及下丘脑CRH、垂体ACTH、肾上腺CORT含量相当;而D组大鼠GR mRNA在下丘脑及垂体的表达较C、E组较低(P＜0.01),且下丘脑CRH、垂体ACTH、肾上腺CORT含量较C、E组较高(P＜0.05).结论:隔药饼灸能显著上调FD模型大鼠下丘脑、垂体GR mRNA表达,下调其下丘脑CRH、垂体ACTH、肾上腺CORT含量,其作用与逍遥散相当,优于艾炷灸.通过纠正HPA轴中枢相关受体及激素的异常表达,抑制HPA轴功能亢进,改善胃肠动力,这可能是隔药饼灸法治疗FD的另一作用机制.
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淫羊藿合女贞子对激素干预哮喘大鼠糖皮质激素受体亚型及转录因子的影响
目的:研究地塞米松合用中药淫羊藿女贞子对哮喘大鼠糖皮质激素受体(GR)亚型及转录因子的影响.方法:实验大鼠随机分为7组:正常对照(N)组、哮喘模型(A)组、激素干预(GC)组、淫羊藿女贞子(YN)组、淫羊藿女贞子合激素干预Ⅰ组(YN+GC组Ⅰ)、淫羊藿女贞子合激素干预Ⅱ组(YN+GC组Ⅱ)、淫羊藿女贞子合激素干预Ⅲ组(YN+GC组Ⅲ).哮喘大鼠在激素干预不同阶段合用淫羊藿女贞子,激素撤停2周后处死,检测血清GR亚型含量、肺组织GR亚型mRNA和54种转录因子蛋白表达.结果:中药合激素干预的3个组均显著抑制血清中GR B含量,但上调肺GR B mRNA表达.GC组肺组织有43种转录因子表达较哮喘组下调,仅有1种上调;与GC组比较,中药合激素干预的3个组分别有49种、45种、46种转录因子表达上调.结论:淫羊藿女贞子合用地塞米松的协同抗炎及抑制激素的副作用与影响GR亚型及上调肺转录因子的表达有关.
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左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症大鼠HPA轴及海马糖皮质激素受体表达的影响
目的:探讨复方中药左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症(diabetes mellitus with depression,DD)大鼠HPA轴及糖皮质激素受体的调控作用,阐明其对海马组织的可能保护机制.方法:采用尾静脉注射STZ联合慢性应激建立DD大鼠模型,并按随机数字表法分为模型组、左归降糖解郁方低、中、高剂量组和阳性药组,同时以正常大鼠为对照组.末次给药后,测定各组大鼠血糖值及抑郁行为,病理切片染色观察大鼠海马组织损伤情况,ELISA试剂盒检测大鼠血浆促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropinreleasing hormone,CRH)、促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)、皮质酮(corticosterone,CORT)水平,蛋白免疫印迹法(Western-blotting)检测大鼠海马糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)表达.结果:左归降糖解郁方能显著降低模型大鼠的血糖值和抑郁样行为,海马病理损伤情况得以缓解,且血浆ACTH、CORT水平下降,海马GR蛋白表达上升.结论:左归降糖解郁方能明显改善DD大鼠血糖值和抑郁行为,保护海马神经元,其作用可能与上调GR表达密切相关.
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补肾定喘汤对哮喘大鼠肺组织糖皮质激素受体及血浆皮质酮、ACTH的影响
目的:研究补肾定喘汤防治支气管哮喘的可能机制.方法:用卵蛋白致敏SD大鼠的方法建立哮喘模型,随机分为模型组、必可酮组、补肾定喘汤组.采用放射性配基竞争结合分析法测定肺组织糖皮质激素受体(GR);用放射免疫分析法测定血浆促肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质酮.结果:哮喘大鼠肺组织GR升高(P＜0.01),血浆ACTH下降(P＜0.01),血浆皮质酮降低(P＜0.01).补肾定喘汤能使肺组织过高的GR水平下降(P＜0.05),可升高血浆ACTH和皮质酮水平(P＜0.01).结论:补肾定喘汤能调节肺组织GR水平,兴奋垂体-肾上腺皮质系统.
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寒、热证豚鼠变应性鼻炎糖皮质激素受体活性研究
目的:研究寒、热证豚鼠变应性鼻炎糖皮质激素受体(GCR)活性.方法:以寒、热性中药灌胃造成豚鼠寒、热证证候,再以10%甲苯二异氰酸酯的橄榄油溶液点鼻造成变应性鼻炎模型,观察变应性鼻炎模型豚鼠外周血白细胞GCR的活性.结果:外周血白细胞GCR活性以寒证变应性鼻炎豚鼠低,热证组次之,正常对照组较高.结论:外周血白细胞GCR活性在寒证变应性鼻炎呈低下状态.
