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Notch配体的原核表达与纯化及其对四氯化碳损伤后造血的影响
目的:通过原核表达并纯化靶向内皮细胞的小鼠Notch重组配体mD1R蛋白,观察其对四氯化碳损伤后造血的影响.方法:PCR克隆并构建pET22b(+)-mD1R表达载体,转化大肠杆菌,IPTG诱导,镍珠亲合层析纯化,SDS-PAGE确认目的蛋白表达.应用流式细胞术、细胞粘附实验、免疫荧光染色及实时定量RT-PCR检测蛋白的内皮靶向性和Notch激活程度.建立四氯化碳损伤小鼠模型,应用流式细胞术观察mD1R蛋白对造血干细胞(HSC)、髓系和淋系细胞的影响,应用磁珠分选Lin-Scal-1+ c-Kit+细胞并分析细胞周期的变化,RT-PCR检测IL-10的表达.结果:成功克隆并构建原核表达载体,获得高纯度且有生物学活性的mD1R重组蛋白.mD1R能激活四氯化碳损伤小鼠造血干/祖细胞的Notch信号途径,内源性扩增HSC和长期HSC达2.96倍和6.18倍,促进了髓系祖细胞及髓源性抑制细胞的自体扩增,尤其有利于粒/单核细胞进入血液循环,其具体机制可能与Notch信号促进应激损伤后造血干细胞增殖和上调IL-10表达有关.结论:成功构建了连接造血干细胞和造血微环境的新型Notch配体活性蛋白,证实Notch信号途径可能通过促抗炎因子表达,实现应激损伤后自体造血动员.
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Notch信号在增生性瘢痕表皮中的表达
目的 研究Notch信号相关分子在增生性瘢痕表皮中的表达情况,探讨其是否参与增生性瘢痕的形成. 方法 收集年龄、性别、部位互为对照的增生性瘢痕和健康皮肤组织各8例.行免疫组织化学检测:①表皮分化标志物,包括整合素β1、角蛋白14(K14)和19(K19);②Notch受体1～4以及配体Jagged1.行Real-time PCR和免疫组织化学检测Notch下游基因P21和P63的表达以及定位. 结果 组织学检测发现增生性瘢痕表皮较健康表皮明显增厚,基底上层细胞层数显著增多.表皮干细胞标志整合素β1、基底细胞层短暂扩充细胞标志K19和有丝分裂后细胞标志K14的表达在增生性瘢痕表皮中明显减少(P<0.05).增生性瘢痕Notch1和Jagged1表达在基底上层角质形成细胞中阳性细胞明显多于健康皮肤(P<0.05).增生性瘢痕表皮P21表达较正常表皮增多,而P63表达则明显降低(P<0.05). 结论 增生性瘢痕角质形成细胞表达过量的受体Notch1和配体Jagged1,通过上调下游基因P21表达,下调P63基因表达,刺激瘢痕表皮过度分化,从而参与增生性瘢痕的形成.
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内耳毛细胞再生的前体细胞及其发育调调控基因
自从在鸟类等非哺乳脊椎动物中发现毛细胞再生现象至今已有20年,人们对毛细胞再生的研究也取得了丰硕的成果,而且有可能从试验性研究向临床应用性研究发展.目前对内耳毛细胞再生方面的研究,尤其是再生毛细胞的前体细胞和再生机制的探讨日益增多.本文将对毛细胞再生的前体细胞进行简单介绍,并对参与内耳毛细胞形成的相关蛋白,Notch信号途径及Math1基因进行综述,以进一步了解毛细胞产生的机制.
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Notch信号通路在肾纤维硬化中机制及其阻断意义
1 Notch机制研究 初在果蝇基因缺陷研究中发现Notch信号途径,1983年,果蝇的Notch被克隆出[1,2].Notch信号通路是进化中高度保守的信号转导通路,其调控细胞增殖、分化和凋亡的功能,几乎涉及所有组织和器官.Notch蛋白是位于细胞膜上的一个单次跨膜异二聚体受体,包括细胞外亚基(NEC)和跨膜亚基(NTM)二者以非共价二硫健结合.
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Notch信号通路在T淋巴细胞发育和功能中的作用
T淋巴细胞的发育是由严格的遗传程序调控的精细过程,而Notch信号通路是这一高度复杂遗传程序中为关键的一环.Notch还与T细胞的激活和功能密切相关.此外,大量的临床和实验室研究证实,Notch信号途径的关键分子是多种人类遗传病的致病基因.Notch1受体基因的染色体易位或点突变是大多数成人T淋巴母细胞白血病的原因.该文将结合此研究室的工作,综述这一领域的相关进展.
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LIM结构域蛋白FHL1C抑制Notch信号途径的转录激活研究
目的:克隆人表达FHL1C基因以及建立真核表达栽体和慢病毒栽体.方法:从人的骨骼肌细胞来源的cDNA中扩增并克隆人FHL1C基因的编码区,连接至pMD-18T载体酶切鉴定后测序.序列测定确认后,双酶切pMD18T-FHL1C回收片段,插入真核表达载体,构建真核表达栽体pCMV-Myc-FHL1C酶切鉴定正确后,转染Hela细胞及Cos7细胞,用Western Blot检测其在转染细胞中的表达,用双荧光素报告基因系统检测其对Notch信号作用.构建FHL1C-IRES-GFP表达单元,建立慢病毒表达载体plenti6/V5-FHL1C-IRES-GFP,包装慢病毒后感染培养的细胞,用免疫荧光显微镜、Western Blot检测分析其在被感染的细胞中的表达.结果:通过PCR方法成功扩增了人FHL1C基因的编码区.通过转染Hela及Cos7细胞,使用Western Blot检测其蛋白水平表达,双荧光报告基因系统分析均能够下调激活的Notch信号.成功构建了FHL1C慢病毒表达栽体pLenti6/V5-FHL1C-IRES-GFP,包装慢病毒,把获取的慢病毒感染细胞后通过荧光显微镜证实被感染的细胞绿色荧光蛋白正确表达,Western Blot检测证实其表达.结论:成功建立起FHL1C真核表达载体及慢病毒表达系统,为研究急性T淋巴细胞白血病与Notch信号转导通路之间的关系奠定了基础.
关键词： FHL1C 急性T淋巴细胞白血病 慢病毒 Notch信号途径 -
泛素连接酶对Notch信号途径的调节作用
Notch信号途径是生物进化过程中高保守的信号通路,对细胞的定向发育及成熟起到决定性的作用.Notch信号途径受到多种分子机制的严格调控.近年来,多项研究均突出了泛素化在调控Noah信号途径活性中的重要性.本文就四种E3泛素连接酶Su(dx)/Itch、Sel-10、LNX以及Neuralized对于调控Noah受体及Notch信号途径配体的研究现况作一综述.
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Notch信号途径对放疗后骨髓谱系造血重建的影响及其机制
目的 探讨Notch信号途径对放疗后骨髓谱系造血重建的影响及其机制.方法 通过交配获得骨髓造血细胞特异性敲除Notch信号MxCre+ RBP-Jflox/flox的双转基因小鼠(敲除组)和未敲除MxCre+ RBP-Jflox/+对照小鼠(未敲除组),给予全身一次性60Co-γ射线电离辐照,观察辐照后第7天两组生存状态、造血重建情况.C57/B6小鼠接受全身一次性60Co-γ射线电离辐照,通过腹腔注射Notch配体重组蛋白D1R或PBS分别建立Notch信号激活小鼠(激活组)和未激活小鼠(未激活组),观察给药第7天重组蛋白D1R的体内活性、两组造血重建情况以及髓系前体细胞周期、增殖信号通路变化.另取C57/B6小鼠随机分为阴性对照组、D1R组、阳性对照组,D1R组和阳性对照组同时接受等剂量60Co-γ射线电离辐照后腹腔注射D1R和PBS,阴性对照组不予处理,停药3个月,观察重组蛋白D1R长期毒性.结果 与未敲除组比较,敲除组生存状态更差,骨髓造血干/祖细胞、骨髓和外周血有核细胞及髓系细胞形态正常,但数量明显减少(P均<0.05).与未激活组比较,激活组骨髓造血细胞Notch信号活化片段ICN1的核表达增多,Notch信号激活,骨髓造血干/祖细胞、骨髓和外周血有核细胞及髓系细胞数均明显高于对照组(P均<0.05),骨髓髓系前体细胞G0/G1期比例减少,S期比例增多,PI3K蛋白表达增加(P均<0.01).停药3个月,D1R组细胞形态、组织构架及造血谱系与阴性对照组无明显差别,但骨髓造血干/祖细胞、骨髓和外周血髓系细胞数明显高于阳性对照组(P均<0.05).结论 Notch信号途径可正向调控放疗后造血重建,尤其髓系重塑,其机制可能与Notch信号激活髓系前体细胞PI3K增殖信号通路、加快细胞周期进程有关.
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DLL4与VEGF在膀胱移行细胞癌中的表达和意义
目的:探讨DLL4和VEGF在膀胱移行细胞癌(BTCC)中的表达和意义.方法:采用免疫组化(S-P法)结合计算机图像定量分析技术检测50例BTCC组织和10例正常膀胱组织中DLL4和VEGF的表达情况,测定平均光密度(MOD).结果:BTCC组中DLL4和VEGF阳性表达率分别为90% (45/50)和64%(32/50),对照组膀胱组织中DLL4无表达,1例VEGF阳性表达,DLL4与VEGF在BTCC组织和正常对照组表达均有统计学意义(P
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Notch信号对内耳毛细胞发育的调控机制
近研究认为,Notch信号途径调节的侧抑制参与哺乳动物内耳感觉前体细胞定向分化为毛细胞和支持细胞的过程及其嵌合体的形成~([1]),在该信号途径中,使用γ-分泌酶抑制剂后,Notcb信号途径中级联反应效应被抑制,其下游转录因子Hesl和Hes5的表达减少,间接增加了Math1的表达,因而可能促进内耳毛细胞的发育.本文就Notch信号途径参与毛细胞发育的调控机制作一综述,以期对耳蜗毛细胞再生机理有更深认识.
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Notch信号途径在血管形成和内皮细胞中的作用
Notch信号途径除了可以直接调控免疫细胞的发生和功能外,还可以通过血管内皮细胞影响免疫应答.血管形成(angiogenesis)是成年个体血管生长重要的方式,不仅参与组织的发育与再生,还参与多种疾病如肿瘤的发生和进展.血管形成主要的调控信号是血管内皮生长因子及其受体组成的信号途径.近年来的研究表明,进化上高度保守的Notch信号途径也是血管形成的重要调控信号途径.Notch信号途径可参与血管形成中的多个步骤,如顶端细胞的分化、内皮细胞的增殖、成熟血管结构的形成等.此外,Notch信号途径还参与血管形成相关疾病的发生和进展.尤为引入注目的是,近来发现Notch信号途径是肿瘤新生血管的重要调控信号,提示深入揭示Notch信号在血管形成中的作用和机制极有可能为开发新生血管靶向治疗提供靶点.
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Notch信号途径对胶质瘤干细胞的调控机制研究
神经胶质瘤是中枢神经系统常见的恶性肿瘤,大多恶性程度高、侵袭性强.手术治疗目前仍是首选甚至是唯一的治疗手段,但远期效果往往不佳,因而复发率和病死率较高.目前已经发现,在人脑神经胶质瘤中存在具有神经干细胞特征的肿瘤细胞,即胶质瘤干细胞.这些肿瘤干细胞具有增殖快、可分化、易成瘤、耐药耐辐射等特点,因此被视为是胶质瘤恶性表型的根源和潜在的治疗靶点[1].然而,胶质瘤干细胞的调控并不完全清楚.因此寻找到胶质瘤干细胞调控的关键信号途径和核心调控分子是对胶质瘤干细胞进行分子干预的前提.Notch信号途径是正常神经干细胞调控的核心信号途径之一.大量研究表明,Notch信号途径可维持神经干细胞的低分化状态、调控神经干细胞的增殖、凋亡和分化方向,因此在中枢神经系统发育中发挥关键作用.有研究提示Notch信号途径也在胶质瘤干细胞中发挥着重要作用,本文旨在阐述Notch信号途径及其在胶质瘤干细胞中的作用.
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人Delta-like4ext-93-217原核表达、纯化及蛋白活性检测
目的:原核表达、纯化融合蛋白TRX/hD114ext-93-217,并对其活性进行检测.方法:采用PCR方法扩增hDll4ext-93-217多核苷酸序列,克隆人pMD18T载体.测序正确后,将其亚克隆入pET32a(+)原核表达载体,获得pET32a(+)-hDll4ext-93-217载体.以该载体转化E.coli菌株BL21,IPTG诱导其表达.以镍离子螯合柱纯化目的蛋白,采用SDS-PAGE,Western Blot方法鉴定目的蛋白的表达;采用萤光素酶报告基因系统检测目的蛋白活性.结果:通过PCR扩增获得了目的片段hDll4ext-93-217,成功构建了该蛋白的原核表达载体pET32a(+)-hD114ext-93-217.采用SDS-PAGE,Western Blot等方法均可检测到目的可溶性融合蛋白TRX/hDll4ext-93-217的表达.融合蛋白TRX/hDll4ext-93-217在25℃,IPTG终浓度0.5mmol/L条件下诱导表达8 h的蛋白表达量高.以镍离子螯合柱纯化,获得纯化融合蛋白TRX/hDll4ext-93-217浓度为1.5g/L,其荧光素酶报告基因的刺激活性与空白对照组及TRX组相比较差异具有显著性(P=0.0154,P=0.0227,P<0.05).结论:通过原核表达获得的可溶性融合蛋白TRX/hDll4ext-93-217可活化Notch信号途径.
关键词： Detla-like4 Notch信号途径 造血干细胞 原核表达 -
核基质MINT N端片段(365～1084aa)相互作用蛋白的筛选及鉴定
目的:确定核蛋白MINT(Msx2-interacting nuclear target Protein)的功能及作用机制. 方法:利用酵母双杂交的方法,以MINT N端第365～1084位氨基酸(MINT-F2)为诱饵用酵母双杂交法筛选小鼠胚胎9日的cDNA文库. 用诱饵质粒和文库先后转化酵母宿主后,对1.0×108个酵母克隆进行营养筛选和β-半乳糖苷酶筛选,获得128个阳性克隆. 并提取质粒进行酶切鉴定,将获得的4个非重复克隆并进行序列分析. 结果:筛选出4个与MINT-F2相互作用的蛋白,它们分别是:67 ku层黏连蛋白受体,,2个16 S核糖体RNA,精氨酰-tRNA合成酶. 结论:成功筛选出与MINT-F2相互作用的蛋白,为进一步研究MINT的功能及作用机制打下基础.
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肝缺血再灌注损伤分子机制的研究进展
肝缺血再灌注损伤(HIRI)是肝手术、肝移植中常见的病理生理现象,是由于进行手术时肝血管被阻断,在阻断移除后,肝血供恢复,然而肝并没有因此恢复正常生理功能,反而造成并加重损伤的现象.现有关于HIRI的研究,主要可以归纳为3种损伤原因:氧化应激,白细胞的聚集,钙超载.这几个方面可以同时发生,相互影响,互相作用.然而关于信号通路方面的研究较少.研究具体的信号通路可以更好地解释HIRI在分子层面的损伤机制,有利于形成预防HIRI的措施,减轻HIRI,促进新药的研发.因此,本文着重信号转导和分子学机制方面的作用,就新的研究进行描述.
