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利用斑马鱼模型研究miR-191对髓系造血分化的调控
目的:利用斑马鱼造血发育模型探索microRNA-191(miR-191)对髓系造血分化的调控.方法:将miR-191和对照(cel-miR-67)通过显微注射斑马鱼受精卵,收集发育到10 s、24 hpf、36 hpf和48 hpf的胚胎,分别提取对照及实验组胚胎的RNA,利用荧光定量qRT-PCR比较斑马鱼胚胎红系细胞分化标记基因(gata1,scl,hbbe3,lmo2)和粒-单系细胞分化标记基因(pu.1,L-plastin,mpx,cebpcα)的表达水平;选取24 hpf胚胎进行上述基因的整胚原位杂交,比较注射miR-191对髓系分化标记基因的原位时空表达的影响.结果:通过分子克隆及T7 RNA聚合酶体外转录成功制备了斑马鱼红系、粒-单系细胞分化标记基因的RNA探针且特异性良好;与注射对照的受精卵相比较,荧光定量qRT-PCR检测发现,注射miR-191的24 hpf和36 hpf斑马鱼胚胎整体中髓系分化基因的水平均有微弱的上调趋势;而发育10 s的胚胎中髓系基因mpx的mRNA表达出现10-20倍的显著上调;整胚原位杂交结果发现24 hpf的胚胎中髓系特异基因L-plastin的原位表达有所上调.结论:本研究建立了斑马鱼受精卵显微注射技术及分析胚胎髓系分化基因表达的两种方法;miR-191对斑马鱼胚胎髓系分化调控功能的研究结果显示,该miR-NA可能参与调控粒-单核系和红系分化,其对髓系基因mpx表达调控的分子机制及相应功能有待进一步的研究.
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BAMBI基因过表达人结肠癌细胞移植斑马鱼致肝转移模型的构建
目的：构建BAMBI基因过表达人结肠癌细胞移植斑马鱼肝转移模型，分析斑马鱼肝内转移性结肠癌细胞BAMBI基因表达水平与肝转移发生率的关联性。方法分别构建BAMBI过表达稳转结肠癌细胞株SW620（BAMBI＋组）、空载体红色荧光蛋白基因转染结肠癌细胞株SW620（EV组），分别显微注射到受精后第2天转基因斑马鱼Tg（Apo14∶GFP）胚胎卵黄囊（每组各680条），激光共聚焦荧光显微镜观察、拍摄，采用ImageJ软件测量转移至斑马鱼肝脏内结肠癌细胞红色荧光表达强度，计算肝转移发生率；采用t检验比较BAMBI＋组及EV组斑马鱼肝脏内结肠癌细胞红色荧光表达强度及肝转移发生率的差异。结果与EV组相比，激光共聚焦荧光显微观察显示BAMBI＋组斑马鱼肝内结肠癌细胞红色荧光表达量显著增加（t=6.247，P=0.0033）；BAMBI＋组斑马鱼肝转移发生率与EV组相比显著增加（t=4.276，P=0.0129）。结论构建了基因修饰人结肠癌细胞移植斑马鱼致肝转移模型，可较好地模拟活体状态的结肠癌肝转移；BAMBI基因可促进异种移植入斑马鱼的结肠癌细胞发生肝转移。
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氨基糖苷类药物耳毒性的斑马鱼模型的研究
氨基糖苷类抗生素因其抗菌谱广、抗菌能力强,半个多世纪以来一直是临床上常用的抗菌素之一.但氨基糖苷类抗生素具有很强的耳毒和肾毒作用,在药物致聋因素中排在首位.本研究以庆大霉素(gentamycin)、新霉素(neomycin)、链霉素(streptomycin)等3种氨基糖苷类抗生素为代表性药物,研究其对斑马鱼胚胎发育的毒性作用和对幼体毛细胞的损伤作用,并探索了该损伤与听觉相关基因之间的联系.结果显示:①3种药物的致死作用都具有明显的浓度依赖性,其致死作用的强弱顺序为链霉素＞新霉素＞庆大霉素;②3种药物处理的5 dpf(day past fertilization)幼体出现身体失衡及体位异常,以及耳囊结构的异常变化;③毛细胞染色实验可观察到,3种药物作用的毛细胞和神经丘均出现明显的损伤和数量减少;④与听觉器官发育相关的基因eyal、val、otx2、dlx6a均随3种抗生素药物浓度的升高,出现差异性的表达水平下调.本研究首次探索了这3种耳毒性氨基糖苷类抗生素处理与斑马鱼听囊结构和听觉基因表达的相关性;并证明利用斑马鱼建立简便、准确、直观、快速地检测药物耳毒性的模型和检测方法的可行性.
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斑马鱼模型和相关技术及其在内分泌系统的应用和前景
斑马鱼是一种热带淡水鱼,与其他动物模型相比在生物学、基因组学和遗传学方面有独特的优势.目前,在一些系统,如血液和神经系统,斑马鱼已经成为研究发育以及疾病非常有力的工具.随着斑马鱼模型的日渐成熟和相关研究技术的不断发展,其已逐步被应用于内分泌系统.本文主要对斑马鱼模型的优势、相关技术及其在内分泌领域取得的研究作简要综述.
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阿霉素对斑马鱼心脏毒性的评估及机制探索
目的:通过观测阿霉素致斑马鱼胚胎产生心脏毒性的表型,及联用右丙亚胺保护剂,建立实验室心脏毒性药物评价及研究的模型.方法:选择受精后24 h的AB系野生型斑马鱼胚胎,分别暴露于不同浓度的阿霉素中后,选择心脏毒性表型明显的阿霉素浓度,将其分别联用或不联用右丙亚胺作用48 h.在斑马鱼胚胎发育至受精后72 h时,在显微镜下观察其心血管系统的形态学改变,记录心率变化,并分别抽提斑马鱼胚胎RNA,检测心脏发育相关基因及氧化、抗氧化相关指标.结果:随着阿霉素浓度的升高,斑马鱼出现了如胚胎发育畸形、心包水肿等改变,且死亡率升高,心脏毒性表型明显的阿霉素浓度为64.40 μmol/L,而联用右丙亚胺(130.47μmol/L、260.93 μmol/L)则可有效挽救阿霉素对斑马鱼心脏的毒性作用,并可分别将其胚胎生存率由35％显著提升至90％和88.3％ (P＜0.001).通过反转录聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测斑马鱼心脏发育相关基因NK2转录因子相关基因5、心肌肌球蛋白轻链2、心房肌球蛋白重链、心室肌球蛋白重链,均未发现显著改变.检测氧化抗氧化指标后发现,64.40 μmol/L的阿霉素可致斑马鱼胚胎丙二醛含量显著上升(P＜0.001),超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性则明显下降(P＜0.001),而右丙亚胺可有效清除丙二醛并恢复SOD活性.结论:成功建立了斑马鱼评价心脏毒药物的模型.阿霉素对斑马鱼胚胎的心脏毒性呈浓度依赖性增加,且与斑马鱼胚胎死亡率亦呈正相关,而右丙亚胺则可有效挽救阿霉素致斑马鱼胚胎的心脏毒性,并降低其死亡率,且此作用与斑马鱼心脏发育相关基因无关,但与氧化及抗氧化通路有明显的相关性.
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AML1-EVI1转基因斑马鱼模型的建立及对造血转录因子的调控
目的:通过建立表达急性髓系白血病(AML)1-同向性病毒整合位点(EVI)1融合基因斑马鱼模型,研究AML1-EVI1融合基因对造血转录因子的影响.方法:构建携带绿色荧光蛋白的AML1-EVI1质粒,显微注射到斑马鱼胚胎单细胞期.建立生殖系稳定转染的转基因模型,常规养殖到F2代.以F2代转基因斑马鱼作为实验对象,运用反转录(RT)-PCR验证AML1-EVI1融合基因的表达,外周血涂片、肾细胞涂片检测血细胞形态学改变,全胚胎原位杂交及荧光实时定量PCR (RFQ-PCR)检测融合基因对造血转录因子[GATA结合蛋白1(GATA1)、髓过氧化物酶(MPO)]的影响.结果:在性成熟146条嵌合表达的F0代斑马鱼中鉴定得到3条(2.1％)转基因阳性斑马鱼,其中雄鱼2条,雌鱼1条.外周血涂片及肾细胞涂片显示转基因斑马鱼出现造血细胞分化障碍,幼稚细胞增多,全胚胎原位杂交及RFQ-PCR均显示,与野生型相比,转基因型斑马鱼造血转录因子MPO基因表达量无论造血细胞发育早期还是晚期都明显下降,转录因子GATA1则在发育早期上调,晚期呈现明显下调.结论:AML1-EVI1融合基因通过调节转录因子抑制髓系分化,红系发育,促进原始细胞增殖.
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转基因斑马鱼模型应用于索拉非尼抗肝癌活性筛选的方法研究
目的 使用斑马鱼(Danio rerio)肝癌模型进行药物筛选,确定筛选方法和适条件.方法 用不同浓度盐酸多西环素(Dox)处理转基因斑马鱼胚胎,诱导其肝脏异常增生,通过综合评价诱导效应与毒性效应,确定适合的诱导浓度;选择适宜的诱导浓度,对索拉非尼抑制肝部异常增生的能力进行评估.结果 确定了盐酸多西环素的适诱导浓度为60 mg/L,索拉非尼对斑马鱼模型的肝部异常增生有显著的抑制作用,同时也观察到药物的毒副作用.结论 该模型适用于索拉非尼及其类似物抗肝癌活性的评价与筛选,是评估化合物体内生物活性的快速筛选模型,同时也可以观测毒副作用,在其它抗肝癌药物及与Ras下游信号通路相关靶点的药物的筛选等方面具有广阔的应用前景.
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斑马鱼侧线神经丘毛细胞发育的研究
目的：研究斑马鱼后部侧线系统神经丘细胞早期迁移及增殖分化过程。方法选取不同发育阶段的野生型斑马鱼胚胎，采用免疫组织化学染色和原位杂交方法，观察斑马鱼后部侧线原基的迁徙以及神经丘的沉积过程，BrdU 标记原基增殖细胞，观察原基细胞团的增殖情况；选择不同发育时期的转基因斑马鱼（Brn3c：mGFP）胚胎，统计绿色荧光蛋白（GFP）阳性表达的神经丘毛细胞数目；采用活细胞染料FM1-43FX标记神经丘中的功能性毛细胞并进行统计计数，BrdU 标记神经丘增殖细胞，观察神经丘细胞的增殖情况。结果受精后20小时的斑马鱼侧线器基板沿水平肌隔开始向后迁移并形成后部侧线神经丘，迁徙速度约为1．7肌节/小时；受精后48小时，初级后部侧线系统基本发育完全，包括躯干部的5～6组神经丘细胞团，尾部的2～3组神经丘细胞团；受精后3、5、7天时的斑马鱼神经丘毛细胞数量分别为5．68±1．46、10．10±0．99、12．45±1．32个；FM1-43FX阳性毛细胞数量分别为3．68±1．11、8．18±1．86、10．22±1．24个。结论受精后3～7天是斑马鱼侧线神经丘毛细胞发育的活跃时期。
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落新妇苷对斑马鱼心脑血管疾病模型的作用研究
目的：考察落新妇苷在心脑血管疾病方面的作用。方法利用斑马鱼血管新生损伤模型、斑马鱼出血性中风模型及斑马鱼心脏损伤模型考察落新妇苷在心脑血管方面的作用。结果在1 mmol/L浓度下落新妇苷恢复了血管生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂( VRI )所诱导的血管损伤模型中新生血管的生长，在节间血管( ISV)损伤区域恢复生成了70%以上的完整血管，但对斑马鱼心脏损伤模型和斑马鱼出血性中风模型未见明显效果。结论落新妇苷对血管损伤导致的血管新生不足具有显著的治疗作用。
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国产利福平口服制剂质量评价
目的:采用法定检验方法与探索性研究方法相结合评价国产利福平口服制剂的质量现状及存在问题.方法:按照2010年度国家评价性抽验计划总体要求,采用现行标准对抽验样品进行法定检验;建立或完善了用于探索性研究的多个方法:采用添加原料识别辅料的方法,建立了口服制剂中利福平晶型判别的粉末X-衍射法,对国内外胶囊所用原料进行测定;目测法观察胶囊内容物的颜色,考察其与晶型的关系;建立判定利福平胶囊制剂所用原料晶型的近红外定性模型;采用HPLC - UV -ESI - IT - MSn联用技术,借助MatLab分析软件,对药典色谱条件下色谱图中主要色谱峰进行结构认定,并采用SPSS软件对上述数据进行统计分析;采用斑马鱼模型对比利福平及其部分有关物质对斑马鱼胚胎发育的毒性;分别采用常压干燥、减压干燥和卡氏法测定不同处方胶囊中的水分含量.结果:法定检验:检验226批利福平口服制剂,222批合格,合格率为98.2％,4批不合格项目均为干燥失重;探索性研究:国内胶囊和片剂所用利福平原料均为Ⅰ型,国外主要为Ⅱ型,部分为Ⅰ型;胶囊内容物所用原料为Ⅰ型的呈鲜红色,Ⅱ型的呈暗红色,与粉末X-衍射结果一致;从有关物质检出的类型、个数和检出量结果显示,国产利福平胶囊在杂质谱层面上均优于进口利福平胶囊;6种利福霉素类化合物的斑马鱼胚胎致死作用由强及弱依次为:利福霉素S-钠盐＞利福霉素SV ＞3 -甲酰利福霉素SV＞醌式利福平＞利福平＞＞N-氧化利福平,其毒性类型主要与其母环结构有关,毒性大小与其3位取代基结构相关;采用原料直接灌装的胶囊,3种水分测定方法测得的数据无显著性差异,但辅料较多的胶囊,卡氏法测定结果明显高于干燥失重法的结果.结论:目前国产利福平口服制剂的制剂工艺较为稳定,总体质量较好,胶囊杂质水平总体优于国外产品;个别企业也存在违规现象,需加强自我约束;现行利福平口服制剂质量标准存在缺陷,有待完善.
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斑马鱼模型在中医药领域的研究与应用
斑马鱼模型在人类疾病模型研究、新药筛选、药物毒性与安全性评价等方面有着极高的应用价值.为促使我国斑马鱼技术再次进入发展的快车道,相关从业人员应该积极探究斑马鱼技术在不同领域的应用和发展对策.中医药学是我国研究人体生命健康保健、养生和疾病预防、诊疗和康复的传统医学,在我国医疗界占据着举足轻重的地位.为推动中医药事业进一步发展,有必要了解当前斑马鱼模型在中医药领域研究中的应用现状,探究斑马鱼模型与中医药研究相结合的新思路.
