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鹿茸中药复方对去卵巢骨质疏松症大鼠肾组织Msx2 mRNA及蛋白表达的影响
目的:观察去卵巢骨质疏松症大鼠肾组织Msx2 mRNA及蛋白表达,探讨绝经后骨质疏松症(Postmenopausal Osteoporosis,PMOP)的发病机制以及鹿茸中药复方的疗效机理.方法:去卵巢复制骨质疏松症大鼠模型,实验设正常组、模型组、假手术组、鹿茸中药复方组、钙尔奇D组、骨疏康组,灌胃给药12周.应用双能X线骨密度仪检测骨密度,实时定量RT-PCR及Western Blot检测Msx2 mRNA及蛋白表达.结果:与正常组比较,模型组股骨骨密度明显降低、肾组织Msx2 mRNA及蛋白表达明显降低;与模型组比较,鹿茸中药复方组、骨蔬康组股骨骨密度明显升高;鹿茸中药复方组、钙尔奇D组、骨疏康组肾组织Msx2mRNA表达明显上调;鹿茸中药复方组肾组织Msx2蛋白表达明显上调;与钙尔奇D组、骨疏康组比较,鹿茸中药复方组肾组织Msx2 mRNA及蛋白表达均明显升高.结论:PMOP的发病机制之一可能是肾组织Msx2 mRNA及蛋白表达降低,鹿茸中药复方可能通过上调肾组织Msx2 mRNA及蛋白表达,有效防治PMOP,其作用优于钙尔奇D和骨疏康.
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骨形成过程中两条重要的信号传导通路
Wnt信号通路与BMP-2信号通路能够促进成骨细胞的分化和成骨细胞分泌的胞外基质的生物矿化,在这一过程中起着极其重要的作用.本文主要综述了,近年来对这两条信号通路研究的新进展.
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胰腺癌耐药细胞株JF305/CDDP和PANC-1/GEM的生物学特性及新耐药相关基因MSX2的发现
目的 建立胰腺癌耐药细胞株,探寻新的胰腺癌细胞耐药基因并初步研究其作用机制.方法 采用大剂量间歇诱导法建立对顺铂(CDDP)和吉西他滨(GEM)耐药的细胞株.采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测其半数致死量(IC50)、耐药指数(R)及交叉耐药情况,并观察其生长差异.应用流式细胞术检测耐药细胞的周期变化,Transwell迁移实验检测其迁移能力的改变,实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测细胞中多药耐药相关基因的变化.结果 成功获得对CDDP耐药的细胞株JF305/CDDP和对GEM耐药的细胞株PANC-1/GEM.JF305/CDDP和PANC-1/GEM细胞株的耐药指数分别为15.3和27.31,并存在交叉耐药.与亲代细胞相比,JF305/CDDP细胞的生长增殖速度减慢,第4天时吸光度(A)值分别为0.60±0.01和1.00±0.06(P=0.002);JF305/CDDP细胞的G1+G2期细胞比例增加[(70±3)％和(55±3)％],而S期细胞比例减少[(30±2)％和(45±2)％,P=0.041];JF305/CDDP细胞穿过Transwell小室的数量增加[(158±5)个/视野和(32±1)个/视野,P<0.001];JF305/CDDP细胞中多药耐药基因1(MDR1)、多药耐药相关蛋白2(MRP2)和同源(异型)框基因2(MSX2)的表达量增加到(5.10±0.63)倍、(7.20±0.84)倍和(6.95±0.77倍).在JF305细胞中,敲降MSX2则MRP2表达降低(0.69±0.17);在PANC-1细胞中,过表达MSX2则MRP2表达升高(2.1±0.31).结论 成功建立了2株稳定的耐药胰腺癌细胞株JF305/CDDP和PANC-1/GEM.发现了新的耐药相关基因MSX2,MSX2可能通过上调MRP2的表达促进胰腺癌细胞耐药.
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补肾益髓中药复方对糖皮质激素性骨质疏松症大鼠肾组织Msx2mRNA及蛋白表达的影响
目的:观察糖皮质激素性骨质疏松症( GIOP)大鼠肾组织Msx2 mRNA及蛋白表达,探讨GIOP的发病机制以及补肾益髓中药复方的疗效机理.方法:肌注地塞米松复制GIOP大鼠模型,实验设正常组、模型空白组、补肾益髓中药复方组、补中益气颗粒组、血府逐瘀胶囊组、骨疏康颗粒阳性对照组,造模及灌胃给药9周.应用XR-26型双能X线骨密度仪测定股骨骨密度,实时定量RT-PCR及Western Blot检测肾组织Msx2 mRNA及蛋白表达.结果:与正常组比较,模型空白组股骨骨密度明显降低(P＜0.01),肾组织Msx2 mRNA及蛋白表达明显降低(P＜0.01)；与模型空白组比较,补肾益髓中药复方组股骨骨密度明显升高(P＜0.01),肾组织Msx2 mRNA及蛋白表达明显上调(P＜0.01).结论:肾组织Msx2 mRNA及蛋白表达降低可能是GIOP的发病机制之一；补肾益髓中药复方可能通过上调肾组织Msx2 mRNA及蛋白表达,有效防治GIOP.
关键词： 糖皮质激素性骨质疏松症 补肾益髓中药复方 Msx2 -
Msx2条件性基因敲除小鼠动物模型的建立和表型的初步研究
目的 利用Cre/LoxP系统建立晶状体组织特异性Msx2基因敲除小鼠模型,并初步研究其表型.方法 设计基因敲除方案,获得条件基因敲除小鼠Msx2cko和对照野生型小鼠Msx2wt.通过PCR技术对小鼠或E10.5和E14.5胚鼠进行基因型鉴定,通过整胚LacZ染色鉴定Le-Cre重组酶活性,同时通过对P1小鼠晶状体组织行HE染色进行初步表型观察.结果 通过基因型检测证实了Msx2基因敲除小鼠模型建立成功,LacZ染色显示Le-Cre重组酶特异性表达在发育中的小鼠胚胎形成晶状体板的表面外胚叶特定区域.Msx2cko P21小鼠表现为小眼球畸形,眼周至鼻线性脱毛.HE染色显示Msx2cko小鼠晶状体体积减小及晶状体茎形成.结论 初步建立了Msx2条件性基因敲除小鼠模型,Msx2条件基因敲除后引起小鼠晶状体发育异常,小眼球畸形.
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先天性小耳畸形候选致病基因的筛选
目的 应用Affymetrix SNP 6.0芯片技术筛选先天性小耳畸形的候选致病基因.方法 对3例小耳畸形患者血液基因组进行Affymetrix SNP 6.0芯片分析,采用Birdseed软件分析样本的芯片数据,通过Minor Allele Frequency对在患者和汉族人参考样本中有显著差异的单核苷酸多态性(SNP)进行筛选.结果 得到SNP相关基因4180个,根据已知文献收集和耳部发育相关并被SNP 6.0注释的基因共5个,包括MSX1,MSX2,GSC,HOXA2和PRKRA.结论 应用Affymetrix SNP 6.0芯片技术筛选出5个先天性小耳畸形的候选致病基因,分别是MSX1,MSX2,GSC,HOXA2和PRKRA.
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小鼠肌节同源盒基因同系物2条件性敲除在先天性白内障发生中的作用
目的:研究晶状体中肌节同源盒基因同系物2(Msx2)条件性基因敲除与先天性白内障发生的关系.方法:实验研究.选取条件性基因敲除小鼠Msx2CKO(Msx2fl/fl/Le-Cre+)为实验组,野生型小鼠Msx2WT(Msx2fl/fl)为对照组.取胚胎17.5 d(E17.5)Msx2WT小鼠胚胎头部组织作冰冻切片,采用RNA原位分子杂交方法检测Msx2在眼组织内的正常表达.取2组小鼠E17.5和生后8 d(P8)眼球组织石蜡切片HE染色观察晶状体组织形态学变化.比较2月龄Msx2CKO和Msx2WT小鼠晶状体质量和直径,组间比较采用独立样本t检验.结果:本研究观察到超过50％的2月龄Msx2CKO小鼠眼部出现角膜轻微混浊,晶状体变小(质量和直径),晶状体混浊及小眼球畸形.石蜡切片HE染色观察到Msx2CKO E17.5及P8小鼠晶状体内分化的纤维细胞排列紊乱,赤道部晶状体上皮细胞及邻近的纤维细胞中有空泡,排列明显紊乱.2月龄Msx2CKO组小鼠的直径小于Msx2WT组小鼠(t=4.80,P<0.05),重量小于后者(t=14.29,P<0.05).结论:Msx2基因对小鼠晶状体发育起重要的调控作用,晶状体条件性敲除该基因可引起先天性白内障发生.
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BMP2及Msx2在特发性高钙尿肾结石患者肾乳头组织表达的研究
目的:研究骨形态发生蛋白2(BMP2)及成骨样细胞转录因子Msx2在特发性高钙尿(IH)肾结石患者肾乳头组织中表达以及探讨其在IH患者结石形成中作用机制.方法:筛选特发性高钙尿肾结石患者8例(IH组),排除各种已知可能影响血清钙或者尿钙的继发疾病；选择同期因肾肿瘤或非结石所致的无功能肾需行肾切除术的患者8例(NC组).分别取16例患者肾乳头组织若干,各标本应用实时荧光定量PCR检测BMP2和Msx2 mRNA的表达,并应用Western blot测定两组蛋白质表达水平.结果:IH组BMP2的mRNA表达量为(1.491±0.121),而NC组BMP2的mRNA为(1.032±0.034),两组间表达量差异有统计学意义(P＜0.05)；而IH组与NC组Msx2的mRNA表达量分别为(1.432±0.091)和(1.015±0.017),两组数据差异有统计学意义(P＜0.05).Western blotting检测BMP2蛋白提示NC组和IH组蛋白质表达量分别为(1.475±0.042)和(1.681±0.153),两组数据差异有统计学意义(P＜0.05)；测定Msx2蛋白水平表达显示NC组为(1.531±0.134),而IH组(1.603±0.156),两者差异无统计学意义(P＞0.05).结论:特发性高钙尿(IH)肾结石患者肾乳头BMP2和Msx2 mRNA表达增强为间质异位钙化特征,BMP2信号通路在特发性高钙尿结石患者Randall钙斑形成中具有一定作用.
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BMP2和MSX2在特发性高钙尿肾结石患者肾乳头组织表达的研究
目的:研究骨形态发生蛋白2(BMP2)及成骨样细胞转录因子MSX2在特发性高钙尿(IH)肾结石患者肾乳头组织中的表达,探讨其在IH患者结石形成中的作用机制.方法:筛选特发性高钙尿肾结石患者8例(IH组),排除各种已知可能影响血清钙或尿钙的继发疾病；选择同期因肾肿瘤或非结石所致的无功能肾需行肾切除术的患者8例(NC组).分别取16例患者肾乳头组织若干,各标本应用实时荧光定量PCR检测BMP2和MSX2 mRNA的表达,并应用Western blot测定两组蛋白质表达水平.结果:IH组BMP2的mRNA表达量为1.491±0.121,而NC组BMP2的mRNA为1.032±0.034,两组间表达量差异有统计学意义(P＜0.05)；而IH组与NC组MSX2的mRNA表达量分别为1.432±0.091和1.015±0.017,两组比较差异有统计学意义(P＜0.05).Western blotting检测BMP2蛋白提示NC组和IH组蛋白质表达量分别为1.475±0.042和1.681±0.153,两组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；测定MSX2蛋白水平表达显示NC组为1.531±0.134,而IH组为1.603±0.156,两者比较差异无明显统计学意义(P＞0.05).结论:IH肾结石患者肾乳头BMP2和MSX2mRNA表达增强为间质异位钙化特征,BMP2信号通路在IH结石患者Randall钙斑形成中具有一定作用.
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糖尿病大鼠钙化血管中Msx2和Wnt3a的表达
目的 研究糖尿病对血管钙化的影响及Msx2和wnt3a基因在钙化血管中的表达变化.方法 将48只雄性wistar大鼠随机分为四组:维生素D3和尼古丁诱导的单纯血管钙化组(n=12)、链脲佐菌素诱导的单纯糖尿病组(n=12)、链脲佐菌素联合维生素D3和尼古丁诱导的糖尿病合并血管钙化组(n=12)和正常雄性Wistar大鼠为正常对照组(n=12).测定大鼠血糖、血清胰岛素、总胆固醇和甘油三酯水平,以血管von Kossa染色、血管钙含量和碱性磷酸酶活性作为判断血管钙化程度的指标,测定大鼠血管中Msx2和wnt3a mRNA 的表达.结果 与正常对照组相比,单纯血管钙化组大鼠血管中Msx2和wnt3a mRNA 相对表达量有所升高(P<0.05),但血管钙含量和碱性磷酸酶活性无明显变化.与正常对照组及单纯血管钙化组相比,糖尿病合并血管钙化组大鼠的血管中,可见沿中膜弹力层内广泛分布的钙盐沉积,大鼠血管中钙含量和碱性磷酸酶活性以及血管内Msx2和wnt3amRNA 相对表达量明显增高(P<0.05).结论 糖尿病可以明显加速血管钙化的发生和发展.在糖尿病大鼠钙化血管中,骨形成过程中的转录因子Msx2和Wnt3a表达增高,提示血管钙化是一个类似于骨形成的过程,Msx2和Wnt3a 参与血管钙化病变的发生.
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敲低MSX2对胰腺癌PANC-1细胞上皮-间充质转化的影响
目的：研究MSX2基因在胰腺癌PANC-1细胞的上皮-间充质转化（EMT）/间充质-上皮转化（MET）转变中的作用。方法通过脂质体2000将含有MSX2干扰序列的质粒（共3种，分别命名为shMSX2-1、shMSX2-2和shMSX2-3，转染空质粒的阴性对照组NC）转染PANC-1细胞，利用Real-time RT-PCR、Western blot等技术检测MSX2在基因和蛋白水平的表达，检测干扰效率，并选取干扰效率高的一组用于后续试验；进而检测EMT相关上皮标志分子E-cadherin、间质标志分子Vimentin在基因和蛋白水平的表达变化；采用CCK-8法检测干扰前后细胞的增殖能力变化，Transwell和划痕试验比较细胞的侵袭转移能力变化。结果3组干扰质粒中shMSX2-1的干扰效率高，CCK-8试验结果显示敲低MSX2可明显抑制PANC-1细胞增殖能力，与对照组相比差异有显著性（P<0.05）；敲低MSX2可明显抑制PANC-1细胞的侵袭转移，差异有统计学意义（P<0.05）；EMT相关分子E-cadherin表达升高，而Vimentin表达降低，且与对照组相比均有统计学意义（P<0.05）；倒置显微镜下观察敲低MSX2后细胞形态由松散的长梭形变成紧密连接的椭圆形。RT-PCR发现敲低MSX2后转录因子twist和snail表达降低（P<0.05），而slug和zeb1表达变化无差异（P>0.05）。结论敲低MSX2可抑制胰腺癌PANC1细胞的增殖、侵袭转移能力，并且上皮标志分子E-cadherin表达升高，间质标志分子Vimentin表达降低，有发生MET的趋势，MSX2可能通过twist、snail发挥其抑制作用。
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小鼠牙胚发育帽状期Msx2、BMP-4基因的表达和意义
目的：探讨Msx2、BMP-4基因在小鼠牙胚发育帽状期的表达及其与牙胚形态发育的关系。方法：利用原位杂交的方法观察小鼠牙胚帽状期Msx2、BMP-4基因的表达方式；利用原位末端标记法（TUNEL法）研究牙胚细胞凋亡情况。结果：Msx2、BMP-4基因在牙胚的发育中有表达，帽状期牙胚细胞的凋亡主要集中于釉结处。结论：Msx2、BMP-4参与了牙胚的发育。
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信号网络在牙齿发育中的作用
转录因子Msx2、Runx2可通过Smad信号通路和p38 MAPK信号通路对成釉细胞合成外基质起重要作用;FGFs能直接调控Msxs的表达并参与Smad信号通路,也能通过参与活化MEK-ERK信号通路间接下调Smads转录活性,从而达到调控Smad信号通路的目的;Pitx2可通过Nodal/Sonic hedghog信号通路影响牙胚分化及外基质的合成;转录因子Msx2能通过Smad信号通路和Wnt信号通路影响釉基质的分泌,说明Msx2作为两种信号通路的交叉点在牙齿发育过程中是不可缺少的.本文就Msx2、Runx2、FGF2、Bmp、Pitx2等转录因子通过多种信号通路的相互调控对牙齿发育的影响作一综述.
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MINT蛋白(1～365氨基酸)与Vav1相互作用及其位点的验证
目的: 明确MINT(Msx2-interacting nuclear target protein) N-末端与Vav1之间的相互作用,进一步探讨MINT的转录抑制调控功能及其机制.方法: 以克隆有MINT-F1片段(1～365氨基酸)的pGBKT7-F1质粒作为诱饵,分别与pACT2-V23#,pGADT7-V620,pACT2-V8900,pGADT7-SH2和pGADT7-SH3几个克隆有Vav1不同结构域的质粒,用酵母双杂交方法分析它们之间的相互作用.结果: pACT2-V23#与pGBKT7-F1之间、pACT2-V8900与pGBKT7-F1之间有比较明确的相互作用,而pACT2-V23#与pGBKT7-F2～F6、pGBKT7-F1与pGADT7-V620、pGADT7-SH2和pGADT7-SH3之间均无相互作用.结论: ① MINT N-端的F1段与Vav1发生相互作用;② Vav1与MINT的F1段发生相互作用的区域位于其SH2-SH3-C端结构域,而且独立的Vav1 SH2或SH3-C端结构域均不能发挥与MINT的F1段产生相互作用的功能.
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核基质MINT N端片段(365～1084aa)相互作用蛋白的筛选及鉴定
目的:确定核蛋白MINT(Msx2-interacting nuclear target Protein)的功能及作用机制. 方法:利用酵母双杂交的方法,以MINT N端第365～1084位氨基酸(MINT-F2)为诱饵用酵母双杂交法筛选小鼠胚胎9日的cDNA文库. 用诱饵质粒和文库先后转化酵母宿主后,对1.0×108个酵母克隆进行营养筛选和β-半乳糖苷酶筛选,获得128个阳性克隆. 并提取质粒进行酶切鉴定,将获得的4个非重复克隆并进行序列分析. 结果:筛选出4个与MINT-F2相互作用的蛋白,它们分别是:67 ku层黏连蛋白受体,,2个16 S核糖体RNA,精氨酰-tRNA合成酶. 结论:成功筛选出与MINT-F2相互作用的蛋白,为进一步研究MINT的功能及作用机制打下基础.
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核基质MINT C端片段(2226-2959)相互作用分子的筛选与鉴定
目的:为了研究MINT的功能及其转录抑制的机制,筛选与MINT相互作用的蛋白.方法:以MINT第2226-2959氨基酸(F5为诱饵,用酵母双杂交法筛选小鼠胚胎9 d的cDNA文库.用诱饵质粒和文库先后转化酵母宿主后,对4.5×106个酵母克隆进行了营养筛选和α-半乳糖苷酶筛选,获得51个阳性克隆.从中提取质粒进行酶切鉴定,获得10个非重复克隆,对此10个克隆进行序列分析.结果:筛选到的3个基因分别为MINT,α-晶状体蛋白结合蛋白1(A1phaA-CRYBP1)和核受体辅抑制因子1(N-CoR1).在酵母中分析了N-CoR1与MINT的作用区段,N-CoR1与MINT的2226-2959和2960-3576两个片段均有相互作用.结论:①MINT在细胞内可能形成二聚或多聚体;②除了RBP-J和MSX2外,MINT还可能调节AlphaA-CRYBP1的活性;③MINT可能通过N-CoR1募集组蛋白去乙酰化酶(HDAC)进行转录抑制.
