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磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1在Notch1诱导的小鼠急性T淋巴细胞白血病发展中的作用
目的:应用Mx1-cre;LoxP系统,建立可诱导敲除PDK1的Notch1诱导的急性T淋巴细胞白血病小鼠模型,观察PDK1在急性T淋巴细胞白血病发展过程中的作用.方法:用流式细胞术检测小鼠骨髓白血病细胞的周期和凋亡率,应用实时荧光定量PCR检测小鼠白血病细胞中肿瘤相关基因和转录因子的表达水平.结果:成功建立诱导敲除PDK1的T-ALL小鼠模型;体内诱导PDK1敲除后,与对照组相比,敲除组白血病小鼠的生存期明显延长(P＜0.01);PDK1敲除对白血病细胞的周期无影响;敲除组小鼠骨髓白血病细胞的凋亡率显著高于对照组(P＜0.001);PDK1的敲除引起肿瘤相关基因和转录因子c-Myc和NF-κB表达水平降低(P＜0.01)以及P53表达水平升高(P＜0.01).结论:PDK1的敲除可抑制T-ALL的发展,推测其机制可能是通过调控白血病细胞的凋亡和多种转录因子的表达来影响白血病的进程.
关键词： PDK1 Notch1 条件基因敲除 急性T淋巴细胞白血病 白血病小鼠模型 -
Smad4 条件基因敲除小鼠听功能初步研究
目的 对Smad4条件基因敲除后三种不同基因型小鼠野生型+/+、杂合子+/-、纯合子-/-进行听功能检查,初步确定Smad4条件基因敲除后小鼠的听力学表型特征.方法 对Smad4条件基因敲除后同窝出生的三种不同基因型小鼠野生型+/+、杂合子+/-、纯合子-/-分别进行听性脑干反应(ABR)和听神经复合动作电位(CAP)的检查,判断Smad4条件基因敲除后三种基因型小鼠是否有听力的改变;如果听力有所改变,再将两种方法 相结合以综合判断听力改变可能的病理部位.结果 各个月龄的Smad4条件基因敲除后的纯合子小鼠各频率的ABR阈值均在100dB SPL以上,有的甚至在大给声刺激都无法引出可识别的波形.野生型和杂合子小鼠都可以诱发出可辨别、可重复的ABR波形.听神经动作电位的结果与脑干诱发电位结果相似,纯合型小鼠各个频率均未引出动作电位波形,另外两种基因型小鼠可以引出稳定的CAP波形.结论 Smad4条件基因敲除后小鼠由于基因的缺陷而出现了重度感音神经性耳聋,纯合子小鼠出现全聋.
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Smad4 条件基因敲除小鼠前庭终器形态学研究
目的 研究Smad4条件基因敲除小鼠前庭终器形态改变,探讨Smad4基因对于前庭发育的作用.方法 利用建立的Smad4条件基因敲除小鼠模型,通过光镜观察Smad4(+/+)、Smad4(+/-)与Smad4(-/-)三种基因型小鼠(0.5、1.5月龄)的球囊及囊斑、椭圆囊及囊斑、半规管及壶腹嵴、前庭神经节、内淋巴管与囊的形态结构、毛细胞的形态及排列缺失情况.通过扫描电镜观察球囊斑、椭圆囊斑和壶腹嵴的形态结构、毛细胞及纤毛的排列缺失情况.结果 Smad4(-/-)小鼠个体及内耳明显小于Smad4(+/+)和Smad4(+/-),而后面二者区别不大.所有小鼠的球囊及囊斑、椭圆囊及囊斑、半规管、前庭神经节、内淋巴管与囊的大小和结构正常,淋巴囊腔饱满,囊斑处的感觉上皮、耳石、毛细胞及纤毛排列整齐,没有发现明显的病变,三个基因型间没有差异.Smad4(-/-)小鼠壶腹嵴囊性变多且严重、后半规管壶腹嵴出现明显的副嵴、偶尔可见壶腹嵴感觉上皮空泡样变.壶腹嵴的毛细胞和支持细胞排列整齐,形态无明显改变,未见缺失.扫描电镜示球囊斑、椭圆囊斑、后、外、上半规管壶腹嵴正常,三个基因型之间没有差异.结论 Smad4(-/-)小鼠的前庭终器有轻微病理改变,Smad4(+/+)与Smad4(+/-)小鼠的前庭终器形态结构基本正常,表明Smad4对于前庭终器的发育影响可能不明显.
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ALK2基因敲除对小鼠股骨骨形成及骨吸收影响的研究
目的 探究激活素受体样激酶2(Alk2)功能缺陷对出生后小鼠股骨骨形成、骨吸收的影响,并探讨其相关机制.方法 首先用Cre-loxp重组酶系统培育出Alk2条件基因敲除小鼠,通过基因型鉴定筛选出实验组(基因型:Osx-Cre;Alk2fx/fx)和对照组(基因型:Osx-Cre;Alk2fx/+).于出生后21天取材、固定,HE染色观察股骨骨量的差异.抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色,比较破骨细胞的差异.提取股骨组织的RNA,通过Real-Time PCR检测成骨相关基因Col1、Alp、Runx2、Bsp、Ocn基因的表达.结果 小鼠股骨HE染色结果显示,基因敲除组小鼠股骨的骨量明显大于对照组.TRAP染色结果提示,对照组中破骨细胞多于基因敲除组.股骨组织中提取RNA的Real-Time PCR结果,基因敲除组中Col1、Alp、Runx2、Bsp的表达升高,Ocn的表达明显降低.结论 Alk2基因敲除导致小鼠股骨骨量减少,这一作用是通过成骨细胞和破骨细胞双向介导的.
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基于Cre/LoxP系统建立软骨组织特异性印第安刺猬蛋白基因敲除小鼠模型
背景:印第安刺猬蛋白(Ihh)条件性基因敲除小鼠动物模型的建立,实现了印第安刺猬蛋白条件性基因敲除能够在时间和组织上具有选择性,能够为进一步研究与生长板有关的严重遗传病提供实验基础.目的:基于Cre/LoxP系统建立软骨组织特异性印第安刺猬蛋白基因敲除小鼠模型,并进一步观察其表型变化差异.方法:SPF级亲代Ihhfl/fl小鼠与Col2a1-CreERT2小鼠,均由美国布朗大学魏垒教授赠予.将亲代Ihhfl/fl小鼠与Col2a1-CreERT2小鼠杂交,获得基因型Col2a1-CreERT2,Ihhfl/-小鼠;再将此基因型小鼠自交,获得刚出生的小鼠.通过琼脂糖凝胶电泳对刚出生小鼠进行基因鉴定,随机分为2组:实验组小鼠于出生后第1天开始腹腔注射玉米油溶解的20 g/L他莫昔芬10μL,连续注射3 d;对照组小鼠腹腔注射等量玉米油.出生后第6天RT-qPCR检测印第安刺猬蛋白基因的敲除率;第8天小鼠膝关节行番红固绿染色、Von Kassa染色进行初步表型观察;第8周行小鼠大体形态观察、记录后肢股骨/胫骨长度,后肢X射线片观察.结果与结论:①通过RT-qPCR证实了印第安刺猬蛋白条件性基因敲除率为76.83％,8周龄小鼠大体形态表现为肢体短小畸形(P<0.01);②X射线显示敲除小鼠胫骨明显缩短且骨骺端发育异常;③番红固绿染色显示印第安刺猬蛋白条件性敲除表达在发育中的小鼠胫骨生长板软骨组织这一特定区域;④Von Kassa染色显示Ihhd/d小鼠生长板过早闭合;⑤初步建立了印第安刺猬蛋白条件性基因敲除小鼠模型,印第安刺猬蛋白条件性基因敲除后引起小鼠生长板区软骨细胞增殖紊乱,生长板区软骨细胞提前矿化,生长板过早骨化闭合,小鼠表现为肢体短小畸形.
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条件基因敲除模型及其在眼科研究中的应用
条件基因敲除是在传统基因敲除技术的基础上，应用重组系统，对目标基因突变的范围和时间加以控制的技术。条件基因敲除技术对于特殊致死基因在成体中的功能研究发挥了重要作用。此文就条件基因敲除模型建立的基本方法和在眼科研究中的应用进展加以综述。
关键词： 条件基因敲除 Cre/LoxP重组系统 动物模型 -
Msx2条件性基因敲除小鼠动物模型的建立和表型的初步研究
目的 利用Cre/LoxP系统建立晶状体组织特异性Msx2基因敲除小鼠模型,并初步研究其表型.方法 设计基因敲除方案,获得条件基因敲除小鼠Msx2cko和对照野生型小鼠Msx2wt.通过PCR技术对小鼠或E10.5和E14.5胚鼠进行基因型鉴定,通过整胚LacZ染色鉴定Le-Cre重组酶活性,同时通过对P1小鼠晶状体组织行HE染色进行初步表型观察.结果 通过基因型检测证实了Msx2基因敲除小鼠模型建立成功,LacZ染色显示Le-Cre重组酶特异性表达在发育中的小鼠胚胎形成晶状体板的表面外胚叶特定区域.Msx2cko P21小鼠表现为小眼球畸形,眼周至鼻线性脱毛.HE染色显示Msx2cko小鼠晶状体体积减小及晶状体茎形成.结论 初步建立了Msx2条件性基因敲除小鼠模型,Msx2条件基因敲除后引起小鼠晶状体发育异常,小眼球畸形.
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条件基因敲除技术及应用现状
条件基因敲除技术是近十多年来发展出来的新技术,它可以通过简单的基因敲除改变活体的遗传信息,可以精确的在动物体内引入点突变.并且对基因敲除进行时空的调控,并成为脊椎动物成体中研究基因功能的重要手段.现主要介绍该技术在近几年来在医学研究中的应用.
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ALK2基因敲除小鼠的饲养繁育与基因型鉴定
目的:为了繁育和鉴定体内ALK2基因被敲除的小鼠,特将从美国引进的ALK2基因敲除小鼠进行饲养繁育,继续保种;以及初步探究激活素受体样激酶2(Alk2)功能缺陷对出生后小鼠在生存能力、繁殖能力、主要组织器官的生长状态等方面的影响.方法:首先用Cre-loxp重组酶系统培育出ALK2条件基因敲除小鼠,通过基因型鉴定筛选出实验组(基因型:Osx-Cre;Alk2fx/fx)和对照组(基因型:Osx-Cre;Alk2fx/+).结果:成功饲养和繁殖出从美国引进的小鼠,并成功从中筛选出ALK2基因敲除小鼠.结论:采用正确的饲养、繁殖及基因鉴定方法对筛选出基因敲除小鼠及继续保种意义重大;初步探究小鼠ALK2基因敲除后小鼠的变化为进一步深入研究小鼠的组织器官的生长发育方面的变化及机理奠定了基础.
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小鼠肌节同源盒基因同系物2条件性敲除在先天性白内障发生中的作用
目的:研究晶状体中肌节同源盒基因同系物2(Msx2)条件性基因敲除与先天性白内障发生的关系.方法:实验研究.选取条件性基因敲除小鼠Msx2CKO(Msx2fl/fl/Le-Cre+)为实验组,野生型小鼠Msx2WT(Msx2fl/fl)为对照组.取胚胎17.5 d(E17.5)Msx2WT小鼠胚胎头部组织作冰冻切片,采用RNA原位分子杂交方法检测Msx2在眼组织内的正常表达.取2组小鼠E17.5和生后8 d(P8)眼球组织石蜡切片HE染色观察晶状体组织形态学变化.比较2月龄Msx2CKO和Msx2WT小鼠晶状体质量和直径,组间比较采用独立样本t检验.结果:本研究观察到超过50％的2月龄Msx2CKO小鼠眼部出现角膜轻微混浊,晶状体变小(质量和直径),晶状体混浊及小眼球畸形.石蜡切片HE染色观察到Msx2CKO E17.5及P8小鼠晶状体内分化的纤维细胞排列紊乱,赤道部晶状体上皮细胞及邻近的纤维细胞中有空泡,排列明显紊乱.2月龄Msx2CKO组小鼠的直径小于Msx2WT组小鼠(t=4.80,P<0.05),重量小于后者(t=14.29,P<0.05).结论:Msx2基因对小鼠晶状体发育起重要的调控作用,晶状体条件性敲除该基因可引起先天性白内障发生.
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Smad4条件基因敲出小鼠的前庭功能检测
目的 通过设计的一系列前庭功能检测实验对同窝成组的软骨组织Smad4条件基因敲除野生型、杂合子、纯合子小鼠的前庭功能进行评估.方法 前庭功能检测方法:一般行为观察；空间姿势反射；游泳实验；前庭眼反射(VOR),使用前庭功能检查系统记录眼震电图；短声刺激前庭诱发肌源性电位(VEMP)记录麻醉下椎前颈长肌表面第3颈椎水平的声刺激诱发电位.结果 虽然软骨组织Smad4条件基因敲除小鼠的耳蜗感受声音能力下降,但没有发现软骨组织Smad4条件基因敲除小鼠出现行为、步态、空间姿势反射和游泳实验等前庭综合功能障碍；3个基因型小鼠均能诱出眼震且相互之间没有差别(P＞0.05)；VEMP的潜伏期在3个基因型组间无差异(P＞0.05),与野生型和杂合子相比,纯合子小鼠VEMP的反应阈值明显增加(P＜0.01).结论 只有Smad4条件基因敲除纯合子小鼠的部分球囊功能受到一定程度的影响,其他前庭功能不受影响.
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可回复性胰岛细胞永生化载体phTERT-I-GTKIox的构建与鉴定
目的 构建以人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)为永生化基因、loxP为重组位点的可回复性永生化逆转录病毒载体.方法 采用EcoRI、Sal I双酶切、回收含有EGFP-胸苷激酶融合基因及LoxP序列的逆转录病毒载体pBTGTKlox,将经PCR扩增的IRES序列克隆入其中,构建成pI-GTKlox;将hTERT克隆入pI-GTKlox的EcoR I酶切位点,构建成phTERT-I-GTKlox.进行菌落PCR、酶切、测序鉴定.结果 菌落PCR鉴定5个菌落中2个为阳性克隆.阳性克隆质粒经Eco R I酶切鉴定形成预计的6.5 kb及3.5 kb两个片段,进一步经测序证实插入的hTERT序列无核苷酸突变.结论 成功构建了phTERT-I-GTKlox可回复性永生化逆转录病毒载体,为建立可回复性永生化胰岛细胞奠定了基础.
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条件基因敲除技术在卵泡发育调控机制研究中的应用进展
卵泡发育是受内分泌、旁分泌及基因调节的复杂生理过程.条件基因敲除能选择去除调控特定发育阶段特定细胞或器官的基因,是在体基因功能研究的主要手段.近年来该技术被广泛应用于卵泡发育调控机制的研究.本文综述了条件基因敲除技术在始基卵泡激活、卵母细胞成熟、排卵、黄体形成及早期胚胎发育等机制研究中的应用进展.
