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中医不同治法对骨质疏松症小鼠骨骼、骨骼肌 Ihh 含量影响的比较研究
目的：观察不同治法对骨质疏松症小鼠骨骼、骨骼肌Ihh含量变化的影响，探讨中医防治骨质疏松症的作用机制。方法除正常组外，将OPG基因敲除小鼠随机分为5组，即模型对照组（模型组）、补肾中药组（补肾组）、健脾中药组（健脾组）、活血化瘀中药组（活血组）和对照药组（福善美组）。采用酶联免疫法测定小鼠骨骼、骨骼肌Ihh含量变化。结果①与正常组比较，模型组小鼠骨骼肌的Ihh含量显著降低（ P＜0.01）；与模型组比较，补肾组小鼠骨骼肌的Ihh含量明显升高（ P＜0.05），其次为健脾组（P＜0.05）。②与正常组比较，模型组小鼠骨骼的Ihh含量显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，补肾组小鼠骨骼肌的Ihh含量明显升高（P＜0.01），其次为健脾组（P＜0.01），活血组和福善美组升高程度也比较明显（P＜0.01）。结论①骨质疏松症的形成，可能与骨骼、骨骼肌Ihh含量异常变化有关。②补肾、健脾方法通过提高骨质疏松症大鼠的骨骼、骨骼肌Ihh的含量，对骨质疏松症具有一定的防治作用。
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渐进性咬合紊乱大鼠的髁突软骨中Ihh、Smo及Ptch1表达变化
目的 探讨Indian Hedgehog(Ihh)及其受体Smoothened (Smo)和Patched1 (Ptch1)在渐进性咬合紊乱的大鼠髁突软骨-骨改建中的表达变化情况.方法 选用24只8周龄雌性SD大鼠,实验组施以渐进性咬合紊乱,分别于20和24周后取材,苏木精-伊红染色观察组织形态变化,免疫组化及实时定量PCR方法检测Ihh、Smo和Ptch1的表达情况.结果 髁突软骨后部20周实验组明显增厚(F=4.39,P=0.003),但24周组有所缓解.免疫组化检测24周实验组Ihh的表达水平高于对照组(F=3.78,P=0.02),而20周实验组Smo的表达水平高于对照组(F=5.16,P=0.04).实时定量PCR结果显示,20周实验组Ihh (F=7.80,P=0.012)和Smo(F=15.67,P=0.003)的mRNA水平均高于对照组;24周实验组Ihh的mRNA水平表达水平显著高于对照组(F=13.34,P=0.013),Ptch1的表达差异无统计学意义(F=1.34,P=2.13).结论 渐进性咬合紊乱促进了大鼠髁突软骨中Ihh及其受体Smo的高表达.
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Kallmann综合征的分子遗传学和临床研究进展
Kallmann综合征是特发性低促性腺激素性性腺功能减退症(idiopathic hypogonadotropic hypogonadism,IHH)中常见的类型,是一种较少见的先天性疾病.据报道男性患病率为1/8000,女性患病率为1/40 000,男性患病率远远高于女性,大约为女性的5~6倍[1].在性腺发育不全中,其患病率仅次于Kilinefilter综合征.
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氟中毒大鼠生长板Ihh、PTHrP mRNA及蛋白表达的变化
目的 观察氟中毒大鼠生长板Ihh、PTHrP mRNA及蛋白表达的影响,探讨Ihh信号通路在氟致软骨损伤中的可能作用.方法 32只Wistar大鼠按体重随机分成4组,对照组饮用自来水,染氟组分别饮用含氟50、100和150 mg/L的自来水,3个月后测定大鼠血清及骨组织氟含量,Real-time PT-PCR法检测lhh、PTHrP mRNA表达情况,免疫组化法检测软骨组织中PTHrP蛋白表达情况.结果 染氟组大鼠生长板中Ihh、PTHrP mRNA表达显著高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).对照组大鼠生长板软骨细胞不表达或极弱表达PThrP,而氟中毒大鼠生长板静止层和肥大层软骨细胞细胞质中PTHrP蛋白为阳性表达,且随染氟剂量增加而升高.结论 过量氟可能通过影响Ihh、PTHrP mRNA及蛋白表达水平,造成生长板软骨增殖、分化失衡.
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反转录病毒载体介导Indian hedgehog信号蛋白在C3H10T1/2细胞中的表达及成骨诱导潜能
背景:目前大量研究证实Indian hedgehog(Ihh)信号通路在骨发育中发挥着重要的调控作用.目的:克隆Ihh重组反转录病毒载体,观察Ihh在C3H10T1/2细胞中的表达及其成骨诱导效果.方法:采用分子克隆技术将Ihh基因与增强型绿色荧光蛋白基因克隆到反转录病毒载体pSFG上,包装出假病毒转染C3H10T1/2细胞,在共聚焦显微镜下观察其绿色荧光蛋白强度及转染效率.运用Western blot方法检测Ihh蛋白的表达,观察C3H10T1/2细胞形态学变化,碱性磷酸酶染色检测成骨活性.结果与结论:共聚焦显微镜下观察到大量的绿色荧光表达,Western blot检测结果显示Ihh基因及增强型绿色荧光蛋白基因在C3H10T1/2中呈显著共表达.在体外培养过程中,Ihh能诱导C3H10T1/2细胞形态学发生改变,增加碱性磷酸酶活性,提示Ihh具有诱导C3H10T1/2细胞向骨细胞分化的潜能.
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基于Cre/LoxP系统建立软骨组织特异性印第安刺猬蛋白基因敲除小鼠模型
背景:印第安刺猬蛋白(Ihh)条件性基因敲除小鼠动物模型的建立,实现了印第安刺猬蛋白条件性基因敲除能够在时间和组织上具有选择性,能够为进一步研究与生长板有关的严重遗传病提供实验基础.目的:基于Cre/LoxP系统建立软骨组织特异性印第安刺猬蛋白基因敲除小鼠模型,并进一步观察其表型变化差异.方法:SPF级亲代Ihhfl/fl小鼠与Col2a1-CreERT2小鼠,均由美国布朗大学魏垒教授赠予.将亲代Ihhfl/fl小鼠与Col2a1-CreERT2小鼠杂交,获得基因型Col2a1-CreERT2,Ihhfl/-小鼠;再将此基因型小鼠自交,获得刚出生的小鼠.通过琼脂糖凝胶电泳对刚出生小鼠进行基因鉴定,随机分为2组:实验组小鼠于出生后第1天开始腹腔注射玉米油溶解的20 g/L他莫昔芬10μL,连续注射3 d;对照组小鼠腹腔注射等量玉米油.出生后第6天RT-qPCR检测印第安刺猬蛋白基因的敲除率;第8天小鼠膝关节行番红固绿染色、Von Kassa染色进行初步表型观察;第8周行小鼠大体形态观察、记录后肢股骨/胫骨长度,后肢X射线片观察.结果与结论:①通过RT-qPCR证实了印第安刺猬蛋白条件性基因敲除率为76.83％,8周龄小鼠大体形态表现为肢体短小畸形(P<0.01);②X射线显示敲除小鼠胫骨明显缩短且骨骺端发育异常;③番红固绿染色显示印第安刺猬蛋白条件性敲除表达在发育中的小鼠胫骨生长板软骨组织这一特定区域;④Von Kassa染色显示Ihhd/d小鼠生长板过早闭合;⑤初步建立了印第安刺猬蛋白条件性基因敲除小鼠模型,印第安刺猬蛋白条件性基因敲除后引起小鼠生长板区软骨细胞增殖紊乱,生长板区软骨细胞提前矿化,生长板过早骨化闭合,小鼠表现为肢体短小畸形.
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血管内皮生长因子调节成骨细胞中Ihh和p38MAPK的表达
目的 探讨血管内皮生长因子(VEGF)对大鼠成骨细胞Ihh和p38 MAPK的调节作用.方法 取胎鼠颅盖骨分离培养成骨细胞,采用实时PCR检测成骨细胞中Ihh及其受体Ptch1和p38 MAPK的表达,检测成骨细胞在不同浓度(0,2,20 ng/ml)及不同时间(0,12,24 h)的VEGF作用下Ihh和p38 MPK的表达情况.结果 成骨细胞表达Ihh及其受体Ptch1,同时表达p38 MAPK.随着VEGF浓度的增加,Ihh和p38 MAPK的表达量均明显增加;随着VEGF作用时间的增加,Ibh和p38 MAPK的表达量与对照组相比有明显的增长趋势.结论 Ihh与其受体Ptch1在成骨细胞中共表达,Ihh以自分泌方式调节成骨细胞功能;VEGF上调成骨细胞中Ihh和p38 MAPK的表达,并且VEGF可能通过调节P38 MAPK的表达而影响Ihh的表达,可能存在VEGF-p38 MAPK-Ihh通路.
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卵巢和卵巢肿瘤中Hedgehog 信号通路的表达
目的 探讨正常卵巢和卵巢肿瘤中Hedgehog信号通路的表达.方法 采用RT-PCR和免疫组织、细胞化学染色检测26例卵巢肿瘤组织、3例卵巢癌细胞株(SKOV3、A2780和COC1)和7例正常卵巢组织中Hedgehog信号通路的信号分子SHH、IHH、PTCH、SMO和GLI1的mRNA和蛋白表达情况;通过实时定量RT-PCR对随机抽取的11例卵巢肿瘤组织和5例正常卵巢组织进行PTCH和GLI1 mRNA水平的比较.结果 SHH、IHH、PTCH、SMO和GLI1的mRNA在卵巢肿瘤组织中均有表达;SHH mRNA在正常卵巢组织中不表达,而IHH、PTCH、SMO和GLI1的mRNA在正常卵巢组织中有表达;在卵巢肿瘤组织中,PTCH和GLI1的mRNA表达水平高于正常组织(P＜0.05).SHH、IHH、PTCH、SMO和GLI1蛋白在卵巢肿瘤组织中均呈阳性表达,在正常卵巢组织中不表达.卵巢癌细胞株SKOV3、A2780和COC1均有IHH、PTCH、SMO和GLI1的mRNA和蛋白的表达;SHH仅在SKOV3和A2780中表达. 结论 卵巢肿瘤中存在Hedgehog信号通路,在部分卵巢肿瘤中有Hedgehog信号通路过度激活的现象.
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Ihh-PTHrP信号轴介导髁突软骨细胞对压力微环境改变的调控研究
目的：探究Ihh-PTHrP负反馈信号通路与静压力下髁突软骨细胞生物学响应的关系。方法体外分离培养4周龄健康雌性新西兰大白兔髁突软骨细胞，100 kPa 静压力条件下，分别对 P2代髁突软骨细胞进行0、1、2、3、4 h 的加压处理；采用Western印迹的方法比较分析髁突软骨细胞 COL2A1、Ihh 和 PTHrP的蛋白表达变化；通过 RT-qPCR检测分析静压力对 Ihh 和PTHrP基因水平表达的影响；选取0 h和3 h 组，使用扫描电子显微镜扫描分析静压力对髁突软骨细胞形态的影响；采用 SPSS 19．0软件包对数据进行统计学分析。结果 Western印迹实验发现：压力加载3 h后，COL2A1出现明显高表达；Ihh蛋白表达在0～2 h内逐渐升高，在2～4 h内却逐渐降低；PTHrP在0～2 h内蛋白表达逐渐升高，并在2～4 h内维持着一个较高水平的表达。RT-qPCR检测发现Ihh在压力加载1 h时出现明显高表达，而PTHrP则在2 h时出现明显高表达。100 kPa静压力加载3 h后，髁突软骨细胞突起增多、变长。结论兔髁突软骨细胞对压力微环境的改变具有一定的适应能力；适宜的静压力可以提高髁突软骨细胞的成软骨能力；Ihh-PTHrP负反馈信号通路参与髁突软骨细胞对压力微环境改变的适应性改建过程。
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Ihh-PTHrP信号轴调控髁突软骨内成骨相关机制的研究进展
Ihh-PTHrP信号轴调控软骨内成骨过程.近年来,国内外学者对Ihh-PTHrP信号通路的调控机制给予了广泛的关注,相关的调控机制屡见报道,对髁突软骨内成骨机制研究的需求日趋迫切.国内外许多文献报道了相关因子在Ihh-PTHrP信号轴中的重要角色,发现了一些具有指导意义的成果.通过对近几年国内外相关文献的总结归纳,对该信号轴调控髁突软骨内成骨的相关机制研究做一综述.
