首页 > 文献资料
-
IK6过表达慢病毒载体的构建及其在THP1细胞系中的表达和生物学特征
本研究旨在构建人IK6基因过表达的慢病毒载体,观察其在THP1细胞株中的表达及对其生物学特征的影响,为研究该基因在白血病中的作用提供基础.采用RT-PCR方法获得目的基因,并与线性化慢病毒载体pGC-FU重组构建慢病毒载体pGC-FU-IK6-GFP,通过菌落PCR鉴定、测序比对分析,确定克隆的正确性.使用Lipofectamine 2000,将慢病毒载体pGC-FU-IK6-GFP转染293T细胞,测定病毒滴度后转染THP1细胞株,用流式细胞仪检测转染效率,RT-PCR检测靶细胞内IK6 mRNA表达,Western blot检测IK6-GFP融合蛋白,进一步观察THP1生物学特征的改变.结果表明,利用RT-PCR方法获得IK6目的基因并连接到线性化的慢病毒载体上,成功构建具有Amp抗性的pGC-FU-IK6-GFP质粒并转染293T细胞,获得滴度为2.0×109TU/ml的病毒.用目的质粒转染THP1细胞,转染效率可达90％.在靶细胞中检测到IK6 mRNA表达和IK6-GFP融合蛋白表达.IK6能够促进靶细胞克隆形成并且具有抑制凋亡的作用,而对细胞周期无显著影响.结论:成功构建IK6过表达的慢病毒载体,使IK6在THP1细胞株中稳定表达.对靶细胞生物学研究发现IK6极为可能干扰了正常Ikaros蛋白的抑癌作用,并存在潜在的抗凋亡作用,进而在一定程度上促进白血病细胞生长,但对细胞周期无明显影响.该研究为进一步探讨IK6在急性髓系白血病的作用奠定了基础.
-
关键词：
-
蝎素组分Ⅲ对THP1细胞HMGB1表达的影响
目的:研究蝎素组分Ⅲ(Scorpion venom crude Ⅲ,SVC-Ⅲ)对THP1细胞HMGB1表达的影响,探讨蝎素与HMGB1相互作用的机制.方法:不同浓度SVC-Ⅲ(0.1、1.0、10和100 ng/ml)刺激培养THP1细胞48小时后,RT-PCR检测HMGB1 RNA水平表达差异;Western blot检测HMGB1蛋白水平表达情况;激光共聚焦检测HMGB1在细胞中的分布情况.结果:1.0 ng/ml SVC-Ⅲ刺激培养THP1细胞,HMGB1 RNA及蛋白表达水平升高显著,随着SVC-Ⅲ浓度的增加,HMGB1 RNA及蛋白的表达水平反而下降;SVC-Ⅲ刺激培养THP1细胞可引起HMGB1从胞核转移入胞浆.结论:SVC-Ⅲ可以刺激或抑制THP1细胞HMGB1的表达,其作用效果与剂量密切相关.
-
17-β-雌二醇对HMGB1过表达THP1细胞的细胞周期进程的影响
目的:研究17-β-雌二醇联合HMGB1的过表达对人单核细胞系THP1细胞细胞周期和NF-κB转录因子的影响.方法:血清饥饿法同步化细胞周期后,利用脂质体法将pFLAG-CMV-HMGB1转染THP1细胞;10-9mol/L 17-β-雌二醇刺激同步化THP1细胞16、30小时后,流式细胞术检测细胞周期分布,RT-qPCR检测Cyclin A、Cyclin D1的mRNA表达水平,免疫印迹检测HMGB1蛋白的表达;荧光素酶报告基因检测NF-κB的活性.结果:HMGB1过表达的THP1细胞中HMGB1蛋白的表达水平比正常THP1细胞要高3.7倍,血清饥饿法成功将THP1细胞周期同步化,同步化后G0/G1期细胞百分数由53%上升到78%;17-β-雌二醇刺激HMGB1过表达细胞30小时后出现Cyclin A mRNA表达上升为原来的7.9倍,而Cyclin D1 mRNA表达明显下降,G1期细胞百分比由53.11%下降为33.33%,S期细胞百分比由35.43%上升为53.91%,此改变在刺激后30小时达到大值;NF-κB活性在17-β-雌二醇刺激HMGB1过表达细胞明显升高,且时间上提前于细胞周期动力学改变.结论:雌激素对THP1细胞周期调节依赖HMGB1,NF-κB可能参与其中.
-
X线照射对THP1细胞中AIM2炎症小体的影响
研究X线照射对THP1细胞中AIM2炎症小体的影响可为阐述放射性肺炎的发生机制提供一些理论依据.本实验将相同浓度的THP1细胞接种于六孔板,用不同剂量的X线照射细胞后48 h,用RT-PCR检测AIM2在mRNA水平的变化,用western blot检测AIM2在蛋白质水平的变化.Caspase 1活性检测试剂盒检测照射后各组THP1细胞中Caspase 1催化活性的变化.ELISA检测THP1细胞培养基上清中IL-1β水平的变化.结果发现,与对照组相比,经过2、4、6和10Gy的X线照射后,THP1细胞中AIM2基因的mRNA水平上调,同时AIM2的蛋白水平也上调.不同剂量的X线照射后,Caspase 1催化活性增强,且呈一定的照射剂量依赖性.不同剂量的X线照射使THP1细胞培养基上清中IL-1β水平升高,且呈一定的照射剂量依赖性.因此,X线照射活化THP1细胞中AIM2炎症小体,可能作为干预放射性肺炎的靶点.
-
125I标记Toll样受体4-抗体与人单核细胞系THP1的体外结合研究
目的:125I标记Toll样受体4抗体(TLR4)研究其与人单核细胞系THP1细胞体外结合的特性.方法:用125I标记TLR4,以快速硅胶簿层层析纸(ITLC-SG)分析方法鉴定125I标记抗体的放射化学纯度,再用γ计数器测定125I标记抗体与THP1细胞的TLR4结合量,其中特异结合(SB)＝总结合管(TB)-非特异管(NSB).结果:125I标记TLR4-Ab的标记率为80.27%(n=7).用快速硅胶簿层层析纸(ITLC-SG)分析方法鉴定其放射化学纯度都能>95%,测定125I标记抗体的比活度为3.145 TBq·mg-1.结论:125I标记的TLR4-Ab具有良好的标记率和放射化学纯度,且125I标记TLR4-Ab与THP1细胞在体外具有很高结合亲和力.
-
lprG基因表达上调对THP1细胞表达谱的影响
目的 分析lprG基因表达上调对THP1细胞表达谱的影响.方法 建立稳定表达lprG的THP1细胞系,通过qPCR及Western印迹法检测lprG的表达.用RNA-seq分析稳定表达1prG对THP1细胞基因表达谱有何影响.对测序数据进行分析,作GO及KEGG通路的显著性富集分析,并选取6个差异表达基因进行qPCR验证.结果 成功构建稳定表达lprG的THP1细胞系.RNA-seq检测发现共有712个差异表达的基因,其中419个上调,占58.8％,293个下调,占41.2％.富集分析显示,lprG的异位表达可影响THP1细胞多种生理或代谢过程.qPCR结果与RNA-seq结果一致.结论 lprG会影响THP1细胞内与Toll样受体信号通路、补体、细胞吞噬、溶酶体及过氧化物酶体等过程相关的基因的表达,这可为进一步研究lprG与巨噬细胞相互作用机制提供前期基础.
-
丙泊酚对内毒素诱导人单核细胞释放细胞因子和表达SOD1蛋白的影响
目的 观察丙泊酚对内毒素(LPS)诱导人单核细胞(THP-1)表达超氧化物歧化酶(SOD1)的影响及对细胞因子释放的影响.方法 将体外培养的人单核细胞THPI细胞分为四组:正常对照组(C组)、LPS刺激组(L组)、丙泊酚处理组(P组)和丙泊酚预处理合并LPS刺激组(P+L组),并用Western blot法检测各组内SOD1含量的变化.采用ELISA法检测四组不同处理因素对THP1细胞分泌IL6、IL8、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的影响.结果 在LPS刺激12h后收集细胞,与对照组比较L组中SOD1的表达量明显降低,IL6、IL8、肿瘤坏死因子α (TNF-α)均明显增高(P＜0.01);L+P组中SOD1的表达量明显高于L组,IL6、IL8、TNF-α均明显降低(P＜0.01).结论 体外THP1细胞培养下,丙泊酚可以明显抑制LPS刺激THPI细胞IL6、IL8、TNF-α的大量释放和逆转LPS刺激下对THP1细胞内SOD1表达的抑制.
