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携带CUEDC1基因的慢病毒载体的构建及其对MOLT-4细胞株增殖和集落形成能力的影响
目的:构建过表达人CUEDC1的慢病毒载体pCDH-CUEDC1,利用慢病毒介导的感染获得稳定表达重组质粒的MOLT-4细胞,分析过表达CUEDC1对MOLT-4细胞增殖和集落形成能力的影响.方法:利用RT-PCR的方法获得CUEDC1全长片段,将CUEDC1 DNA片段酶切回收后克隆至慢病毒转移质粒pCDH-CMV-MCS-EFl-copGFP-T2A-Puro(以下简称pCDH),获得pCDH-CUEDC1慢病毒重组质粒.经三质粒包装系统包装后获得高滴度慢病毒颗粒并感染人白血病细胞系MOLT-4,通过流式细胞仪分选获得稳定表达的白血病细胞系,应用real-time PCR和Western blot方法分别检测稳定转染细胞系的CUEDCl mRNA和CUEDC1的表达.应用CCK-8法和集落形成试验测定CUEDC1对MOLT-4细胞增殖和集落形成能力的影响.结果:经限制性内切酶检测及基因测序证实成功构建了携带CUEDC1的重组慢病毒载体;病毒感染MOLT-4细胞后经流式细胞仪分选获得GFP阳性细胞.实时定量PCR及Western blot证实,病毒感染后CUEDC1的mRNA和蛋白表达上调;CCK-8法及集落形成试验显示,过表达CUEDC1促进MOLT-4细胞的增殖和集落形成能力,与对照组相比,均有统计学差异(P＜0.05).结论:成功构建了表达CUEDC1的慢病毒载体,CUEDC1可以促进MOLT-4细胞的增殖和集落形成能力.
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VPA和As2O3对Molt-4细胞的协同作用及可能机制
本研究探讨丙戊酸钠(sodium valproate,VPA)单药或与亚砷酸(arsenie trioxide,As2O3)联用对人急性T细胞白血病细胞株Molt-4增殖活力的抑制、去甲基化作用及其可能机制.用MTT法检测药物对细胞增殖的抑制作用,利用金氏公式观察两药联用体外抗癌的协同作用.采用半巢式甲基化特异PCR(hnMS-PCR)检测p151NK4B基因甲基化,RT-PCR方法检测p15基因、DNA甲基转移酶DNMT-1、DNMT3A、DNMT3B的表达.结果表明:VPA和As2O3 均可明显抑制细胞增殖,二者联用在体外有相加作用(Q值均大于0.85),在5 mmol/L VPA与10 μmol/L As2O3 联用时抑制率达(70.31±2.54)%.Molt-4细胞p15基因因高甲基化而失表达,经VPA和As2O3联合作用后p15基因甲基化程度明显下降,p15基因表达增强,两药联用时DNMT-1、DNMT-3A、DNMT3BmRNA的表达都有下降.结论:VPA可能通过抑制DNA甲基转移酶DNMT-1和(或)DNMT3B使p15INK4B基因去甲基化,使p15基因表达上调,恢复其活性.VPA和As2O3 均可明显抑制Mol-4细胞增殖,两药合用有协同相加作用,可减少砷荆的副作用.
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长春花碱诱导MOLT-4细胞产生M期细胞阻滞的初步研究
本研究探讨化疗药物M期阻滞剂长春花碱(vinblastine,VLS)对MOLT-4急性淋巴细胞白血病细胞株产生的生物学影响并分析其意义.0.05 μg/ml的VLS诱导MOLT-4细胞0-12小时产生M期细胞阻滞和/或细胞凋亡,流式细胞术检测DNA直方图和共聚焦显微镜观测细胞形态,采用阻滞增长率、阻滞效率、凋亡率及形态学指标分析阻滞前后的细胞周期分布、凋亡和细胞形态变化.结果表明,细胞阻滞可不伴随有凋亡率的显著增加;细胞阻滞的流式DNA直方图呈时间依赖的细胞周期分布动态改变,阻滞程度可量化;M期阻滞伴随有S期细胞堆栈;阻滞后细胞增殖率减低;M期阻滞细胞具有特征性细胞分裂的形态学特征.结论:长春花碱能单独诱导MOLT-4细胞M期阻滞,M期细胞阻滞的流式细胞检测和形态学特征的研究有助于进一步研究细胞阻滞与凋亡、检测点机制和抗癌新药开发提供参考.
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TSA诱导MOLT-4细胞中p21WAF1/Cip-1表达的功能机制研究
为了研究去乙酰化酶抑制剂TSA诱导MOLT-4细胞周期阻滞和凋亡反应中p21WAF1/Cip-1的表达及其功能,以组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA处理急性淋巴细胞白血病细胞系MOLT-4,流式细胞仪和细胞吖啶橙染色、瑞士染色检测细胞周期和凋亡,Western检测p21WAF1/Cip-1的表达.结果表明:组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA可有效的诱导MOLT-4细胞发生G2/M阻滞和凋亡,并且呈现明显的剂量效应关系和时间效应关系;在此周期阻滞与凋亡反应过程中,p21WAF1/Cip-1蛋白的表达水平在周期阻滞前快速增高,而在凋亡早期开始下降.p21WAF1/Cip-1分子在细胞中的表达规律与TSA诱导的细胞G2/M阻滞和凋亡反应间存在明显的剂量效应关系和时间效应关系;蛋白酶体抑制剂MG-132提升p21WAF1/Cip-1分子在细胞中的表达可以增进细胞的G2/M阻滞反应而延缓凋亡.结论:蛋白酶体途径参与TSA诱导的MOLT-4细胞周期阻滞向凋亡转换过程中p21WAF1/Cip-1分子的降解调控;p21WAF1/Cip-1在TSA诱导的MOLT-4细胞G1/M阻滞和凋亡反应中起着重要调节作用.
关键词： TSA MOLT-4细胞 p21WAF1/Cip-1 G2/M阻滞 MG-132 -
ICAM-1-GFP的构建及其与Molt-4细胞的结合
本研究构建人细胞间黏附分子1(ICAM-1)全长基因的真核表达载体pEGFP-Cl-ICAM-1,转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)细胞株,并检测其在CHO细胞中的表达及与Molt-4细胞的结合.采用RT-PCR法从健康人外周血中分离单个核细胞,钓取ICAM-1全长基因(1622 bp),与pMD18-T载体连接做全自动序列测定.将测序正确的克隆质粒pMD18-T-ICAM-1和表达载体pEGFP-C1分别用HindⅢ和Ⅰ进行双酶切,应用基因重组技术构建ICAM-1全长基因真核表达载体pEGFP-Cl-ICAM-1,质粒经Hind Ⅲ和Sacll双酶切和PCR电泳鉴定后,采用脂质体转染法转染CHO细胞,并进行G418筛选.用RT-PCR、流式细胞术和荧光显微术检测ICAM-1-GFP的表达及亚细胞的定位,用检测ICAM-1-GFP/CHO细胞与Molt-4细胞的结合能力评价ICAM-1-GFP融合蛋白的功能.结果表明:重组质粒经限制性酶切鉴定得到与ICAM-1全长基因长度一致(1622 bp)的酶切产物;测序分析证实,PCR产物与GenBank上登录的ICAM-1基因(NM_000201)序列完全一致,表明成功地完成了ICAM-1的扩增和表达载体的构建;荧光显微镜下可见转染的CHO细胞有绿色荧光蛋白的表达,表达的融合蛋白较均匀地分布于整个细胞:FACS检测ICAM-1-GFP的荧光转染率为(13±5.5)%,表明ICAM-1-GFP基因进入到CHO细胞并获得了有效表达,成功构建了ICAM-1-GFP/CHO细胞,并且ICAM-1-GFP/CHO细胞能够结合PMA处理的Molt-4细胞.结论:成功构建了ICAM-1-GFP真核表达载体,构建的ICAM-1-GFP真核表达载体在CHO细胞内稳定表达,ICAM-1-GFP/CHO细胞能与Molt-4细胞结合.这为进一步研究ICAM-1分子的功能打下基础.
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PHI调控Molt-4细胞组蛋白甲基化诱导p15基因去甲基化后再表达
本研究探讨异硫氰酸苯己酯(PHI)对急性T淋巴细胞性白血病Molt-4细胞组蛋白H3K4、H3K9甲基化,及p15基因的去甲基化的调控作用及诱导沉默基因重新表达的机制.用Western blot方法检测PHI作用后Molt-4细胞的组蛋白H3K4、H3K9甲基化状态及P15蛋白的表达的变化;应用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测PHI作用前后Molt-4细胞株p15基因甲基化状态的变化;半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测Molt-4细胞经过PHI处理后p15基因的mRNA的表达变化.结果表明,PHI作用于Molt-4细胞可增强组蛋白H3K4甲基化表达,抑制组蛋白H3K9甲基化表达,并呈浓度及时间依赖性;PHI作用于Molt-4细胞5天后,p15基因的甲基化程度减弱,p15基因的异常高甲基化现象被逆转,沉默的p15基因重新表达;p15 mRNA、P15蛋白表达增加,并呈浓度依赖性.结论:PHI可能通过特异性调节组蛋白H3K4、H3K9甲基化水平,引起染色体空间结构发生变化,使p15基因的CPG岛去甲基化,从而诱导p15基因重新表达.
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小檗碱通过Notch途径抑制人T淋巴细胞性白血病Molt-4细胞增殖及凋亡的影响
目的 探讨小檗碱对人T淋巴细胞白血病细胞株Molt-4细胞体外增殖抑制、凋亡诱导及相关机制.方法 CCK-8法检测不同浓度的小檗碱对Molt-4细胞的增殖抑制作用;流式细胞术检测细胞凋亡率;RT-PCR检测Molt-4细胞Notch1、Bcl-xl、Deltex1基因表达情况.结果 小檗碱诱导Molt-4细胞毒性及凋亡作用,呈剂量依赖性(P＜0.05);RT-PCR显示Molt-4细胞株有Notchl mRNA的表达,且随着小檗碱剂量的增加,Notch1、Bcl-xl、Deltex1 mRNA的表达逐渐下降.结论 小檗碱可能通过Notch信号途径抑制Molt-4细胞增殖并诱导凋亡.
关键词： 小檗碱 MOLT-4细胞 Notch1信号途径 凋亡 -
苯乙肼对Molt-4细胞增殖、凋亡及组蛋白甲基化、乙酰化的影响
目的 研究单胺氧化酶抑制剂苯乙肼对急性T淋巴细胞白血病细胞株Molt-4细胞增殖、凋亡及表观遗传学调控的影响.方法 用MTT法检测苯乙肼对Molt-4细胞增殖率的影响,流式细胞术观察苯乙肼对Molt-4细胞凋亡的影响,Western blot法检测caspase-3、Bcl-2、Bax、p21、p15、DNA甲基转移酶1(DNMT1)表达以及组蛋白H3K4、H3K9甲基化及组蛋白H3乙酰化水平.结果 ①5、10、15、20 μmol/L苯乙肼作用24 h后,Molt-4细胞增殖率分别为(87.68±3.54)％、(67.84±3.24)％、(51.48±3.37)％、(28.72±2.56)％,差异有统计学意义(P＜0.05).②10 μmol/L苯乙肼作用24、48、72 h后,Molt-4细胞增殖率分别为(67.84±3.24)％、(50.24±2.01)％、(40.31±2.25)％,差异有统计学意义(P＜0.05).③5、10、20 μmol/L苯乙肼作用24 h后,Molt-4细胞的凋亡率分别为(13.64±2.58)％、(31.24±3.42)％、(56.37±4.26)％,差异有统计学意义(P＜0.05).④苯乙肼上调Bax、caspase-3和p21表达,下调Bcl-2表达,同时上调组蛋白H3K4单甲基化、H3K4二甲基化水平及组蛋白H3乙酰化水平,而对组蛋白H3K4三甲基化、H3K9单甲基化、H3K9二甲基化水平无影响.⑤苯乙肼使Molt-4细胞DNMT1表达下调、p15蛋白表达上调(P＜0.05).结论 苯乙肼可上调Molt-4细胞组蛋白H3K4单甲基化、H3K4二甲基化和组蛋白H3乙酰化水平并上调p21、p15蛋白表达、下调DNMTl表达,终抑制Molt-4细胞增殖、诱导细胞凋亡.
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靶向抑制Molt-4 T细胞增殖的Smo-siRNA:筛选和评价
背景:研究表明,T淋巴细胞白血病的发生发展与Hedgehog通路的异常有关.Smo基因是该信号通路中的关键基因,控制着Hedgehog信号向细胞膜内的传递.目的:筛选一种可以高效抑制Molt-4细胞株增殖和诱导凋亡的小干扰RNA(Smo-siRNA).方法:①根据siRNA设计原理,设计并化学合成Smo-siRNA 1,2,3以及无关干扰序列的阴性对照siRNA;②利用NuclefectorTM核转染仪将以上Smo-siRNA分别转入人T淋巴细胞白血病细胞株(Molt-4细胞),分别在转染24,48,72 h 采用 qRT-PCR 检测 Smo mRNA 相对表达水平,CCK-8法检测细胞生长抑制率, Hoechst33258 染色观察细胞凋亡形态,流式细胞仪(AnnexinV/PI法)检测细胞凋亡率.结果与结论:①利用NuclefectorTM核转染仪成功将Smo-siRNA转入Molt-4细胞,Smo-siRNA 1沉默效果佳,有效降低Molt-4细胞Smo mRNA表达水平(P < 0.05),并且以48 h作用效果明显;②转染后24 h, Smo-siRNA可明显抑制Molt-4细胞生长(P < 0.05);③Hoechst染色证实Molt-4细胞符合凋亡的细胞形态学变化;④与对照组比较,Smo-siRNA1组细胞的凋亡率明显增加(P < 0.05);⑤结果表明,小干扰RNA下调Molt-4细胞Smo基因表达可明显抑制Molt-4细胞增殖,并促进凋亡,提示Smo-siRNA具有作为T细胞白血病靶向基因治疗或者协同治疗的潜能.
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三氧化二砷对Molt-4细胞株Notch信号通路作用机制的研究
目的:探讨三氧化二砷(As2O3)对急性淋巴细胞白血病细胞株Molt-4中Notch1基因的作用机制.方法:采用反转录(RT)-PCR检测正常人外周血淋巴细胞与急性淋巴细胞白血病细胞株A3和Molt-4中Notch1基因mRNA的相对表达量,选取Notch1 mRNA表达量较高的Molt-4细胞,分别经浓度0、2、4μmol/L As2O3处理细胞后,应用细胞计数试剂盒(CCK8)检测细胞活力,显微镜下观察细胞形态学变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率,RT-PCR检测Notch1 mRNA表达率,蛋白质印迹法检测细胞内Notch1、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)及胱天蛋白酶3(caspase-3)凋亡蛋白的表达情况.结果:As2O3能下调Molt-4细胞中Notch1基因及蛋白的表达,降低Bcl-2/Bax蛋白比例,并促进凋亡蛋白胱天蛋白酶3的活化,2μmol/L As2O3处理后,随作用时间延长,Molt-4细胞的凋亡率逐渐增高(r=0.989,P＜0.05).Molt-4细胞分别经2μmol/L和4μmol/L As2O3处理72 h后,流式结果显示,随As2O3浓度升高,Molt-4细胞凋亡率升高(r=1.000,P＜0.05).As2O3以时间和浓度依赖的方式诱导Molt-4细胞凋亡.结论:As2O3通过抑制Molt-4细胞株Notch1信号通路的表达,抑制其增殖并诱导凋亡.
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联合放/化疗对细胞周期特异性凋亡的影响
目的以急性T淋巴细胞白血病细胞株MOLT-4为模型,探讨作用于细胞周期相同或不同时相的放疗/化疗药物联合应用时是否具有抗癌增效作用、引起细胞凋亡的周期时相性是否发生改变及对细胞周期检测点(ckeckpoint)的影响.方法分别将作用于G1期的X-ray(10 Gy)及药物金克(JinKe)(2.0 g/L);S期的喜树碱(CPT)(0.25μmol/L)及阿糖胞苷(Ara-C)(1.00μmol/L);G2/M期的药物威猛(Vm-26)(0.5μg/mL)及长春花碱(Vinblastine,Vin)(0.05μg/mL)分别联合分组应用对其进行不同时间段的培养,采用流式细胞术中的API法对凋亡细胞进行定量并对凋亡细胞的周期时相性进行定位检测.结果G1期的药物JinKe和X-ray(10 Gy)联合应用时,具有协同作用,其作用点仍以G1期细胞为主.S期的两种药物CPT和Ara-C联合应用时,两者也具有协同作用,其细胞周期作用点仍以S期为主.作用于G2/M期的两种药物VM-26和Vin联合应用时,两者还是具有协同作用,但其细胞周期作用点几乎发生在细胞周期的所有时相.作用于G1期的药物JinKe和作用于S期的药物CPT联合应用,具有增强效应,联合应用时其细胞周期作用点以G1期和S期细胞为主.作用于G1期的药物金克和作用于G2/M期的药物VM-26联合应用,两者具有增强效应.作用于G2/M期的Vin和作用于S期的药物CPT联合应用,两者具有增强效应.联合应用时其细胞周期作用点主要以S期细胞为主,并有少量的G2/M期细胞.结论作用于细胞周期同一时相的药物联合应用时,可在各自的检测点发挥协同作用;不同时相的药物联合应用时,均在各自的检测点发挥增强效应.
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双参数流式细胞术检测Molt-4和Jurkat细胞膜受体途径凋亡的始动位点
目的:建立稳定的膜受体途径的细胞凋亡模型,探讨Cyclin/DNA双参数流式细胞术检测膜受体途径细胞凋亡的周期特异性的方法.方法:用典型的受体途径诱导剂TNF-α分别处理Molt-4、Jurkat以及健康人外周血淋巴细胞;应用膜联蛋白V(Annexin V)/碘化丙啶(PI)、API和Cyclin/DNA双参数流式细胞术等方法检测细胞凋亡.结果:Annexin V/PI法检测早期凋亡细胞,早期凋亡率控制在8%～18%的周期特异性凋亡模型典型;API法显示膜受体介导的细胞凋亡主要发生在细胞周期的G1期.Cyclin/DNA双参数流式细胞术显示受体途径的细胞周期特异性细胞凋亡的始动位点为G1早期.结论:应用AnnexinV/PI和API法能为建立稳定而典型的受体途径周期特异性细胞凋亡模型提供技术支撑;Cyclin/DNA双参数流式细胞术能够精确显示受体途径的细胞周期特异性细胞凋亡的始动位点.
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RNA干扰下调bcl11b基因表达对Molt-4细胞增殖和凋亡的影响
目的 分析下调bcl11b基因表达对人T淋巴细胞白血病细胞株Molt-4细胞增殖和凋亡的影响.方法 通过核转技术将bcl11b-siRNA转染Molt-4细胞;在不同时间点分别采用荧光实时定量PCR观察其对bcl11b基因表达的影响;MTT法观察对Molt-4细胞体外增殖的抑制作用;流式细胞术及刘氏染色检测siRNA的诱导凋亡作用.结果 转染后24小时开始细胞生存率均显著降低(P<0.01),细胞发生凋亡,bcl11b基因表达下调.结论 bcl11b-siRNA可抑制Molt-4细胞中bcl11b基因表达,使肿瘤细胞增殖抑制和发生凋亡.
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曲古菌素A对Molt-4细胞细胞周期阻滞和凋亡的作用
目的:本研究旨在探讨曲古菌素A(TSA)对Molt-4细胞的诱导细胞周期阻滞及凋亡的作用及 TSA 高效低毒的抗肿瘤特性.方法:应用细胞培养、PI单标流式细胞术和DNA Ladder等方法初步探讨TSA对Molt-4细胞的诱导细胞周期阻滞及凋亡的作用.结果:在一定浓度范围内,TSA能以浓度依赖性诱导Molt-4细胞S期及G2期阻滞.TSA以浓度依赖性方式诱导 Molt-4 细胞凋亡,随着 TSA 的浓度的升高,细胞凋亡率也显著增高.TSA的各实验组的凋亡率和对照组的凋亡率相比均有显著性差异,P＜0.01.经200 nmol/L的TSA处理后,Molt-4 细胞凋亡率增高,且呈时间依赖性效应关系.TSA 在显著诱导Molt-4细胞凋亡的浓度范围内对正常人外周血单个核细胞(NPBMNC)无明显的诱导凋亡作用.结论:TSA有明确的诱导Molt-4细胞周期阻滞和诱导Molt-4细胞凋亡的能力,并且这种作用呈浓度和时间依赖性,这可能是TSA体外抑制白血病细胞系Molt-4生长和发挥抗白血病作用的主要机理之一,与NPBMNC相比较,TSA能够选择性诱导Molt-4细胞凋亡.
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曲古抑菌素A诱导MOLT-4细胞凋亡的机制
目的 通过研究曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)作用前后MOLT-4细胞基因表达谱的差异,初步探讨TSA诱导细胞周期阻滞和凋亡的机制.方法 TSA以不同浓度和不同作用时间作用MOLT-4细胞,通过流式细胞仪检测其凋亡率的变化.提取细胞RNA,应用基因芯片方法分析TSA作用前后的基因表达变化,RT-PCR验证芯片结果的可靠性.结果 MOLT-4细胞对TSA非常敏感,纳摩尔级水平即可诱导显著的细胞凋亡,而且这种凋亡与TSA作用浓度及时间呈现明显的线性关系.基因芯片结果显示,200 nmol/L TSA作用MOLT-4 24 h后共有952个基因发生不同程度的变化,其中上调的有477种,下调的有475种,部分结果经RT-PCR证实.结论 TSA诱导肿瘤细胞周期阻滞和凋亡是一个多基因参与的复杂过程.
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一种新的双向电泳蛋白样品制备方法
目的 探讨双向凝胶电泳(2-DE)样品裂解液对蛋白质分离和双向凝胶电泳结果 的影响.方法 以MOLT-4细胞为例,采用3种溶解性能不同的裂解液提取细胞中的蛋白质组,并分别进行双向聚丙烯酰胺凝胶电泳.结果 通过对2-D PAGE图谱的比较分析,发现采用8 mol/L Urea, 2 mol/L Thiourea,4% CHAPS, 1% NP-40,4%TritonX-100,65 mmol/L DTT, 0.5 mmol/L PMSF,0.5% pharmalyte 3-10,能获得质量较高的2-DE图谱.结论 采用高浓度脲、三去污裂解液有利于获得优质的蛋白质样品,从而提高蛋白质提取率和双向电泳分辨率等.
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应用基因芯片分析曲古菌素A促人白血病细胞株Molt-4凋亡的机制
背景与目的:研究表明组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)抑制剂曲古菌素A(trichostatin A,TSA)能以较低浓度诱导多种肿瘤细胞凋亡,但具体机制不甚明了.本实验拟研究TSA诱导人白血病细胞株Molt-4凋亡的作用及其分子机制.方法:应用细胞培养、MTT、PI单标流式细胞术、DNA ladder观察TSA诱导Molt-4细胞和健康人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)凋亡的作用,用基因芯片(microarray)、逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和Western blot等方法检测特定浓度TSA作用Molt-4细胞一定时间后基因表达的差异.结果:TSA能以时间、浓度依赖性方式诱导Molt-4细胞凋亡,相同浓度和时间范围内TSA对PBMC无明显的诱导凋亡作用.TSA处理9 h,基因芯片分析发现Molt-4细胞中表达下调的基因有313个.下调基因编码产物包括信号转导分子、转录因子、酶、受体等,其生物学功能包括调节细胞生长、分化发育、凋亡等.其中STAT5A下调80.4%,MYC下调77.3%,ikaros下调83.1%,半定量RT-PCR验证均显示TSA作用9 h后这些基因的表达下调,同时STAT5A及MYC蛋白在TSA作用24 h时表达也明显降低.结论:TSA能诱导Molt-4细胞凋亡并抑制其增殖,但对PBMC无明显作用.TSA对Molt-4细胞的这种选择性诱导凋亡和抑制增殖的机制与促进增殖、抗凋亡基因的变化有关.
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咖啡因对喜树碱诱导Molt-4细胞凋亡的影响
背景与目的:有报道认为咖啡因(caffeine)可以作用于细胞周期检测点,从而影响细胞周期的进程,而这种效应对于肿瘤细胞凋亡的影响尚存在争议.本研究探讨咖啡因对喜树碱诱导Molt-4细胞凋亡的作用及其对细胞周期检测点的效应.方法:用喜树碱诱导细胞凋亡,以咖啡因作为干扰细胞周期检测点的因素.用API法(Annexin V-propidium iodide,Annexin V/PI)及亚C1峰法对细胞凋亡率以及凋亡发生的周期特异性进行检测分析.结果:2.0～20.0 mmol/L的咖啡因对处于对数生长期Molt-4细胞增殖没有影响.喜树碱能诱导Molt-4细胞产生以S期细胞为主的细胞周期特异性凋亡,0.15 μmol/L喜树碱作用4、6 h,细胞凋亡率分别为(23.69±2.26)%、(36.99±1.42)%;10.0 mmol/L咖啡因能显著抑制这种细胞凋亡,与0.15 μmol/L喜树碱联合作用4、6 h后,细胞凋亡率分别下降至(4.79±0.64)%和(2.69±0.56)%.去除咖啡因后,凋亡细胞明显增多,去除4、6 h后细胞凋亡率升至(46.23±0.21)%和(55.81±0.41)%,且仍以S期细胞为主.结论:咖啡因可以抑制喜树碱诱导细胞凋亡.作为影响细胞周期检测点的药物,咖啡因可以明显屏蔽检测点对损伤细胞的监督,抑制细胞凋亡,但其作用是一过性的、可以逆转的.
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SDF-1a/54/KDEL基因电穿孔Molt-4细胞株的转染条件优化
目的 探索以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组质粒pEGFP/SDF-1a/54/KDEL电穿孔悬浮培养的Molt-4细胞的高效转染条件.方法 通过控制脉冲幅度、脉冲电压、细胞生长状态等三个主要条件,采用不同条件组合后用电穿孔法将转入悬浮培养的Molt-4,用荧光显微镜和流式细胞仪观察转染率.结果 传代后第二天的Molt-4细胞在260 V、950 μF得到大转染率51.2%.荧光显微镜下可观察到被转染目的基因的细胞发出绿色荧光.结论 优选260V、950μF和良好的细胞生长状态等条件下的Molt-4,可获得目的基因SDF-1a/54/KDEL的高转染效率.
关键词： 电穿孔 SDF-1a/54/KDEL MOLT-4细胞 基因转染 -
长春新碱诱导白血病MOLT-4细胞凋亡及其机制研究
目的 观察长春新碱(VCR)对人急性淋巴细胞性白血病MOLT-4细胞促凋亡作用,并探讨其作用机制.方法 分别用0、0.01、0.02、0.04、0.08 μmol/L长春新碱处理MOLT-4细胞,然后用CCK-8法检测细胞活性,用Hochest33258对细胞核进行染色,用Rhodamine123对细胞进行染色,检测线粒体膜电位情况.用caspase 8、9、3抑制剂预处理MOLT-4细胞,检测caspase8、9、3对细胞活性的影响.结果 长春新碱对细胞活性具有抑制作用,且呈明确的剂量-效应关系;细胞核染结果显示,长春新碱可以促进细胞凋亡,剂量越大,凋亡现像越明显;同时,长春新碱可以引起细胞线粒体膜电位下降,并发现caspase 9和3参与了细胞凋亡过程.结论 长春新碱可以促进MOLT-4细胞凋亡,作用机制可能是线粒体膜电位下降,进而诱导caspase 9和3活化而促发细胞的凋亡.
关键词： 长春新碱 凋亡 急性淋巴细胞性白血病 MOLT-4细胞
