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MEF2C调控DOK5基因的表达
目的 研究MEF2C对DOK5的表达调控机制.方法 用RT-PCR法检测小鼠中DOK5组织表达谱,检测P19CL6向心肌细胞分化过程中DOK5和MEF2C的表达.MEF2C与DOK5启动子报告基因共转染P19CL6细胞或将DOK5启动子上的MEF2结合位点突变后,观察报告基因活性的变化.结果 DOK5在小鼠的脑、心脏、骨骼肌等高表达.DOK5和MEF2C在P19CL6向心肌细胞分化过程中mRNA表达水平升高(P<0.05).过表达MEF2C可以激活DOK5启动子区的报告基因活性,而MEF2结合位点突变则抑制DOK5启动子区报告基因活性.结论 MEF2C可以通过作用于DOK5启动子区的MEF2结合位点,调节DOK5的转录活性.
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人肌细胞增强因子2C基因慢病毒载体的构建及其在293T细胞中的表达
目的 构建人肌细胞增强因子2C(MEF2C)慢病毒表达载体并检测其表达性能,以便应用过表达技术进一步研究MEF2C的功能.方法 以人MEF2C基因序列为模板合成其编码框序列,通过限制性内切酶Not Ⅰ和Nsi Ⅰ酶切、T4 DNA连接酶连接,将MEF2C插入慢病毒载体质粒LV5-GFP,构建人MEF2C基因重组慢病毒质粒载体,转化感受态细菌,筛选阳性克隆,与包装质粒通过脂质体共转染人胚肾细胞系293T,进行慢病毒包装并测定病毒滴度.病毒感染293T细胞,荧光显微镜下观察感染效率,PCR方法检测MEF2C mRNA的过表达情况.结果 成功构建慢病毒表达载体LV5-MEF2C-GFP,三质粒共转染293T细胞后形成假慢病毒颗粒；浓缩假病毒后测定其滴度为2×109 TU/ml;以复感染系数MOI为5感染293T细胞,感染效率在70％以上.PCR证实感染带有目的基因假病毒的293T细胞表达MEF2C mRNA的水平较感染阴性对照病毒的293T细胞表达水平明显升高(=11.93,P=0.000).结论 成功构建MEF2C慢病毒表达系统,为应用过表达技术探索其在肿瘤发生和发展中的作用奠定了基础.
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沉默MEF2C基因对髓母细胞瘤Daoy细胞形态结构的影响
目的探讨抑制人MEF2C基因后对髓母细胞瘤Daoy细胞形态结构的影响作用。方法实验分为两组：对照组和干扰组。对照组 Daoy 细胞培养感染阴性慢病毒液，干扰组 Daoy 细胞培养感染MEF2C-RNAi慢病毒液。光镜下观察培养细胞的大体形态，然后利用透射电镜观察细胞的超微结构变化情况。同时将两组细胞分别接种至裸鼠背部皮下，观察裸鼠成瘤情况以及肿瘤组织的光镜下结构和电镜下超微结构变化情况。结果干扰组Daoy细胞生长较对照组细胞生长缓慢，种植裸鼠后成瘤重量较对照组轻；光镜下显示对照组瘤组织细胞较干扰组瘤组织细胞排列密集；电镜下显示干扰组瘤组织细胞排列疏松，核固缩，凋亡小体形成。结论沉默MEF2 C基因可以引起异染色质减少、凋亡小体形成，影响细胞的形态结构，抑制肿瘤细胞生长，为其肿瘤生物治疗提供了实验依据。
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MEF2C基因调节猪骨骼肌肌纤维的发育表达
目的 研究肌细胞增强因子2C(MEF2C)基因对骨骼肌肌纤维发育表达的调节情况,并探明二者的相关关系.方法 实验采集猪骨骼肌,提取组织总RNA,采用实时荧光定量PCR技术检测基因在猪生后七个不同时间点的表达情况;提取猪骨骼肌总蛋白,利用免疫共沉淀,用特异抗体沉淀MEF2C及其相互作用蛋白复合物,经SDS-PAGE分离,洗脱蛋白复合物并酶解,电喷雾质谱技术分析及数据库比对,并通过Western blotting验证蛋白的相互作用.结果 猪MEF2C基因在刚出生及生后90d时的表达量高于其他时间点,其发育表达规律与肌纤维相关基因(MyHCslow、MyHC2a、MyHC2x、MyHC2b)的表达趋势类似,成功筛选并鉴定出与转录因子MEF2C相互作用的蛋白为MDHM.结论 MEF2C基因可能参与骨骼肌肌纤维形成与表达,且促进慢肌纤维的表达.
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斑马鱼胚胎发育过程中Mef2c的表达
目的探讨Mef2c在斑马鱼胚胎骨骼肌和心肌中表达的时相变化.方法收集不同发育时期的AB野生型斑马鱼胚胎,采用整体原位杂交技术检测Mef2c在骨骼肌和心肌的转录情况.结果Mef2c在体节中的表达约在13 hpf,而在心脏中的表达出现在13 hpf以后,与体节中的表达时间基本平行.另外,Mef2c在体节和心脏中的表达一直维持到48 hpf.结论明确了Mef2c在斑马鱼胚胎骨骼肌和心肌发育的表达时相变化,为研究斑马鱼早期骨骼肌和心肌发育的调控机制提供了一定的理论基础.
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肌细胞增强因子2C在胶质母细胞瘤中表达及其影响研究
目的:探索肌细胞增强因子2C(myocyte enhancer factor 2C,MEF2C)在人胶质母细胞瘤中表达升高以及其对细胞生物学特性的影响.方法:Western Blot检测胶质瘤病人组织中MEF2C的表达;CCK-8法检测U251细胞在缺血缺氧、氧化应激刺激后细胞活性;Transwell实验检验U251细胞侵袭性.结果:MEF2C在胶质母细胞瘤组织中存在表达升高现象;氧化应激处理后,过表达MEF2C组相对于对照组细胞活性增强(P＜0.01),shMEF2C组相对于对照组细胞活性减弱(P＜0.01);缺血缺氧处理后,过表达MEF2C组相对于对照组细胞活性增强(P＜0.01),shMEF2C组相对于对照组细胞活性减弱(P＜0.001);过表达MEF2C组相对于对照组细胞侵袭性增强(P＜O.001),shMEF2C组相对于对照组细胞侵袭性减弱(P＜0.05).结论:MEF2C在胶质母细胞瘤中高表达,MEF2C提高了U251细胞对缺血缺氧、氧化应激刺激的抗性,同时增强了U251细胞迁移和侵袭特性.
