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选择性线粒体分裂抑制剂抑制大鼠急性脊髓损伤后的细胞凋亡
目的 检测mdivi-1预处理对大鼠急性脊髓损伤(ASCI)后线粒体膜电位,凋亡诱导因子(AIF)释放及细胞凋亡的影响.方法 大鼠随机分为:假手术组(Sham组)、单纯脊髓损伤组(SCI组)、二甲基亚砜预处理组(DMSO组),mdivi-1预处理组(mdivi-1组).采用Allen's方法制备ASCI模型.JC-1标记法检测线粒体膜电位(MMP),Western blot方法检测线粒体及细胞核内AIF,TUNEL法检测细胞凋亡.结果 与Sham组相比,SCI组线粒体中AIF先降低后升高,低点是8h(P＜0.01),而细胞核中AIF却呈相反趋势(P＜0.01),术后8 h MMP明显降低(P＜0.01),凋亡细胞数目明显增多(P＜0.01).与SCI 8 h组相比,mdivi-1组MMP明显升高(P＜0.01),线粒体中AIF明显增多(P＜0.01),细胞核中AIF明显降低(P＜0.01),凋亡细胞数目明显减少(P＜0.01).结论 Mdivi-1具有保护大鼠ASCI后MMP,抑制线粒体中AIF的释放和细胞凋亡的作用.
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选择性线粒体分裂抑制剂对大鼠急性脊髓损伤后神经细胞的保护作用及其机制
目的：检测选择性线粒体分裂抑制剂-1（Mdivi-1）对大鼠急性脊髓损伤（ASCI）后神经细胞线粒体中丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、细胞色素C（Cyt-C）及神经细胞凋亡的影响。方法成年雌性SD大鼠36只，体质量250~300 g，随机分为假手术组（Sham组）、单纯脊髓损伤组（SCI组）、Mdivi-1预处理组（1.20 mg/kg，Mdivi-1组），各12只。Sham组只暴露脊髓，不打击。SCI组和Mdivi-1组采用Allen’s方法制备脊髓损伤模型。Mdivi-1组在脊髓打击之前15 min尾静脉给予Mdivi-1，而SCI组给予等量二甲基亚砜（DMSO）。Sham组在暴露脊髓8 h后立即处死，SCI组和Mdivi-1组均于脊髓损伤后8 h处死；然后取出脊髓节段T9~T11，用分光光度计检测各组脊髓组织线粒体中MDA和GSH的含量，Western Blot法检测线粒体及胞浆内Cyt-C表达情况，荧光TUNEL法观察神经细胞凋亡情况。结果与Sham组相比，SCI组线粒体中Cyt-C和GSH明显减少，但线粒体中的MDA，胞浆中Cyt-C及神经细胞凋亡数目明显增多（P<0.01）；与SCI组相比，Mdivi-1组线粒体中Cyt-C和GSH明显增多，但线粒体中MDA，胞浆中Cyt-C以及神经细胞凋亡数目明显减少（P<0.01）。结论 Mdivi-1具有减轻ASCI后神经细胞线粒体氧化损伤，抑制线粒体中Cyt-C的释放及神经细胞凋亡的作用，促进了脊髓功能恢复。
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杨梅素通过促进DRP1依赖性线粒体分裂诱导人卵巢癌SKOV3细胞凋亡
目的:观察杨梅素与mdivi-1分别或联合作用于人卵巢癌SKOV3细胞后细胞凋亡和线粒体分裂情况,探讨杨梅素诱导SKOV3细胞凋亡的机制.方法:体外培养SKOV3细胞,随机分为对照组、mdivi-1组、杨梅素组和联合给药组,mdivi-1组以50 μmol·L-1 mdivi-1作用1h后更换普通细胞培养液继续培养23 h,杨梅素组以50 g·L-1杨梅素作用24 h,联合给药组以50 μmol·L-1 mdivi-1作用1h后更换含50g· L-1杨梅素的细胞培养液继续培养23 h.MTT法检测各组细胞存活率;Muse(R)凋亡检测试剂盒检测各组细胞凋亡率;蛋白免疫印迹法(Western blotting)观察细胞色素C(Cyt C)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(easpase3)、动力相关蛋白1(DRP1)和分裂蛋白1(FIS1)表达水平;MitoTracker(R) Red荧光探针特异性标记线粒体观察各组细胞线粒体分裂情况.结果:与对照组比较,杨梅素组细胞存活率明显降低(P＜0.05);与杨梅素组比较,联合给药组细胞存活率明显升高(P＜0.05).与对照组比较,杨梅素组细胞凋亡率升高(P＜0.05);与杨梅素组比较,联合用药组细胞凋亡率明显降低(P＜0.05).与对照组比较,杨梅素组细胞中Cyt C和easpase3蛋白表达水平明显升高(P＜0.05);与杨梅素组比较,联合用药组Cyt C和caspase3蛋白表达水平明显降低(P＜0.05).与对照组比较,杨梅素组细胞线粒体分裂程度增强;与杨梅素组比较,联合用药组线粒体分裂程度下降.与对照组比较,杨梅素组细胞中DRP1和FIS1蛋白表达水平升高(P＜0.05);与杨梅素组比较,联合用药组DRP1和FIS1蛋白表达水平降低(P＜0.05).结论:杨梅素可通过促进DRP1依赖性线粒体分裂诱导人卵巢癌SKOV3细胞凋亡.
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线粒体分裂抑制剂Mdivi-1对大鼠心肌微血管内皮细胞缺血再灌注损伤的保护作用
目的:探讨Mdivi-1对缺血再灌注损伤后大鼠心肌微血管内皮细胞(cardiac microvascular endothelial cells,CMECs)的保护作用.方法:分离培养大鼠CMECs,建立缺血再灌注(SI/R)模型,随机分为对照组、SI/R组、和SI/R+Mdivi-1组.采用MTT法检测细胞增殖能力；Transwell法检测细胞迁移能力；Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术检测CMECs凋亡率；western blot法检测各组细胞Drp1,Fis1水平；活性氧检测试剂盒测细胞ROS水平.结果:与对照组比较,SI/R组和SI/R+Mdivi-1组细胞增殖和迁移能力明显降低,凋亡明显增加,Drp1,Fis1表达增高,ROS水平明显升高,结果具有统计学意义(P＜0.05)；与SI/R组比较,SI/R+Mdivi-1组细胞增殖和迁移能力明显增加,凋亡明显降低,ROS水平明显降低,结果具有统计学意义(P＜0.05),而Drp1,Fis1表达则无明显改变.结论:Mdivi-1可减轻CMECs的缺血再灌注损伤,这种保护作用可能是通过抗氧化应激来实现的.
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线粒体分裂抑制剂Mdivi-1改善血管紧张素Ⅱ介导的内皮功能紊乱
动力相关蛋白(dynamin-related protein 1,Drpl)与线粒体的动态变化有着密切的联系,是介导线粒体分裂的主要功能蛋白.本研究旨在探讨血管紧张素Ⅱ (angiotensin Ⅱ,AngⅡ)对血管内皮细胞线粒体融合和分裂的影响以及Drpl功能抑制剂Mdivi-1对AngⅡ介导的内皮损伤是否有减轻作用.AngⅡ或联合Drpl抑制剂Mdivi-1处理人脐静脉内皮细胞(human umbilical vascular endothelial cells,HUVECs)后,用Western blot检测Drpl、eNOS和凋亡相关酶的蛋白表达,用MitoTracker Red染色观察细胞内线粒体形态,用JC-1探针染色检测线粒体膜电位变化,用DCFH-DA染色检测细胞活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)生成,用Transwell实验检测细胞迁移情况,用Annexin V/PI染色检测细胞凋亡情况.结果显示,AngⅡ处理12h后,HUVECs的Drp1的表达水平显著升高,内皮细胞迁移、凋亡及ROS的生成显著增加,eNOS表达量显著降低;同时,AngⅡ处理还诱导了线粒体形态的改变,使网状的线粒体变成了短管状,并伴随着线粒体膜电位的下降.Mdivi-1可以显著逆转AngⅡ对内皮功能的上述损伤作用,提高内皮细胞线粒体膜电位及eNOS的表达量,降低细胞内ROS水平,抑制内皮细胞凋亡及迁移能力.以上结果提示,Drpl抑制剂Mdivi-1可以减轻AngⅡ介导的内皮损伤.
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线粒体分裂蛋白抑制剂对匹鲁卡品致痫大鼠海马神经元的保护作用
目的：研究线粒体分裂蛋白抑制剂（Mdivi-1）对匹鲁卡品（PILO）致痫大鼠海马神经元的保护作用及其机制。方法：121只雄性SD大鼠随机分成对照（ CON）组、PILO组、PILO＋DMSO组和PILO＋Mdivi-1组，PILO组又分为癫痫持续状态（ SE）2 h、8 h、24 h和72 h 4个亚组。观察各组大鼠行为学改变，并分别采用Nissl染色法检测神经元损伤，比色法检测SOD活力及MDA含量，Western blot和RT-PCR法检测Drp1、细胞色素C（ Cyt C）、凋亡诱导因子（AIF）和cleaved-半胱天冬酶3（caspase-3）表达水平。结果：与PILO组（114．571±5．420）相比，PILO＋Mdivi-1组海马神经元数目增加[（157．429±6．183）；F ＝68．693，P ＜0．001]。与 PILO 组 SE 24 h 亚组[（113．429±4．980），（6．102±0．193）]相比，PILO＋Mdivi-1组SOD活力增加[（138．571±3．380）；F＝21．779，P＜0．001]， MDA含量减少[（4．353±0．231）；F＝27．226，P＜0．001]。与PILO组[（0．594±0．020），（1．099±0．015）]相比， PILO＋Mdivi-1组线粒体Cyt C 增加[（0．897±0．015）；F＝296．177，P＜0．001]，细胞质Cyt C 减少[（0．433±0．010）；F＝562．684，P＜0．001]。与PILO组[（0．878±0．037），（1．465±0．076）]相比，PILO＋Mdivi-1组线粒体AIF增加[（1．279±0．051）；F＝59．298，P＜0．001]，细胞核AIF减少[（0．896±0．044）；F＝46．424，P＜0．001]。与PILO组（0．587±0．192）相比，PILO ＋Mdivi-1组 cleaved caspase-3减少[（0．463±0．022）；F ＝40．500，P ＜0．001]。结论：Mdivi-1对癫痫大鼠海马神经元有保护作用，其机制可能与降低氧化应激，抑制Cyt C释放、AIF移位及caspase-3激活有关。
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Mdivi-1减轻异丙酚诱导的发育期神经元凋亡
目的:探讨mdivi-1对异丙酚诱导胎鼠海马神经元凋亡的影响.方法:原代培养孕16～18 d SD大鼠胎鼠海马神经元5d,采用随机数字表法,将神经元随机分为5组(n=6):对照组(C组)、异丙酚组(P组)和不同浓度mdivi-1组(M1～M3组,浓度分别为1,2.5,5μmol·L-1,P组加入异丙酚(终浓度为30μmol·L-1)孵育3 h,M1～3组给予异丙酚前4h加入mdivi-1,使各组mdivi-1浓度分别为1、2.5和5μmol· L-1,C组加入等量生理盐水.检测发育期神经元活性和caspase3活性;Western blot法测定线粒体p-drp1(ser616)、Bax表达;采用实时定量PCR检测BDNF及Bcl-2 mRNA的表达.结果:与C组相比,P组神经元活性降低(P＜0.05),Caspase3活性增加(P＜0.05);与P组比较,M1～M3组神经元活性增高(P＜0.05)、Caspase3活性降低(P＜0.05);与M1组比较,M2-3组神经活性增高(P＜0.05)、Caspase3活性降低(P＜0.05);M2与M3比较,神经元活性及Caspase3活性差异无显著性(P＞0.05),因此后续实验选择M2浓度处理,称为M组.与C组比较,P组线粒体p-drp1(ser616)及Bax表达升高(P＜0.05)、BDNF和Bcl-2 mRNA表达下调(P＜0.05);与P组比较,M组线粒体p-drp1(ser616)及Bax表达降低(P＜0.05),BDNF和Bcl-2 mRNA表达下调(P＜0.05).结论:Mdivi-1通过减少p-drp1(ser616)和Bax向神经元移位,抑制线粒体过度分裂及降低线粒体通透性并且上调BDNF和Bcl-2,从而减轻异丙酚诱导发育期海马神经元凋亡.
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Mdivi-1对Aβ致伤大鼠海马区神经元线粒体凋亡率及drp-1表达的影响
目的:观察线粒体分裂抑制剂(Mdivi-1)对Aβ致伤离体培养的大鼠海马神经元线粒体的凋亡率及线粒体动力相关蛋白1(drp-1)表达的影响.方法:选择出生年龄小于24 h的大鼠,取其海马神经元进行原代培养.将培养的海马神经元细胞分成4组,正常组不给予任何处理,Aβ组在细胞培养基中加入Aβ毒素,Mdivi-1组为在细胞培养基中加入Mdivi-1,Aβ+ Mdivi-1组为在细胞培养基中加入Aβ和Mdivi-1.采用MTT比色法检测细胞凋亡率,Western blot技术检测dip-1的表达.结果:MTT检测结果显示与正常组比较Aβ组的海马神经元凋亡率明显上升,差异有统计学意义(P＜0.05),与Aβ组比较,Aβ+Mdivi-1组的海马神经元凋亡率下降,差异有统计学意义(P＜ 0.05);WB检测结果显示与正常组比较,Aβ组的dip-1表达上调,差异有统计学意义(P＜0.05),Aβ+ Mdivi-1组较Aβ组表达下调,差异有统计学意义(P＜0.05).结沦:mdivi-1能抑制Aβ毒素作用,从而减少神经元细胞线粒体的调亡,drp-1表达的减少也能稳固线粒体的分裂.因此,对Aβ和drp-1的定向干预治疗可能会成为治疗AD的关键靶点.
