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敦煌古方小补心汤对大鼠微血管内皮细胞的保护作用研究
目的 探讨《辅行诀脏腑用药法要》中记载的敦煌古方小补心汤对高糖条件下大鼠心肌微血管内皮细胞(MMVECs)的保护作用.方法 采用敦煌古方小补心汤含药鼠血清干预高糖培养条件下的MMVECs,流式细胞技术观察MMVECs的增殖活力,ELISA法检测MMVECs培养基中血管内皮生长因子(VEGF)分泌量、Q-PCR法检测MMVECs中VEGF的基因表达水平.结果 小补心汤能促进MMVECs增殖,上调MMVECs的VEGF基因表达,增加VEGF分泌.结论 敦煌古方小补心汤在一定程度上能改善糖尿病引起的心血管损伤.
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通心络干预心肌微血管内皮细胞条件培养液对心肌细胞的保护作用
目的 观察心肌微血管内皮细胞条件培养液对心肌细胞的影响及通心络的干预作用.方法 制备3种心肌微血管内皮细胞条件培养液:正常内皮细胞条件培养液(N-CM),同型半胱氨酸诱导损伤的心肌微血管内皮细胞条件培养液(H-CM)和通心络干预的心肌微血管内皮细胞条件培养液(T-CM).将心肌细胞随机分为4组:正常对照组、N-CM组、T-CM组及H-CM组,采用相应培养液培养.倒置显微镜观察心肌细胞形态,酶联免疫吸附法检测细胞上清液心肌肌钙蛋白T(cTnT)含量,JC-1试剂盒测定细胞中线粒体膜电位(MMP),Western blot法检测细胞色素C(Cyt C)和钙网蛋白(CRT)蛋白表达.结果 与正常对照组比较,N-CM组细胞形态无明显变化,细胞上清液cTnT含量、MMP水平、CRT及Cyt C蛋白表达无明显变化(P＞0.05);与N-CM组比较,H-CM组细胞皱缩,细胞边缘模糊,有大量坏死细胞漂浮,细胞上清液cTnT含量、CRT及Cyt C蛋白表达升高,MMP水平降低(P＜0.01);与H-CM组比较,T-CM组细胞无明显皱缩,细胞边缘较清楚,坏死漂浮细胞减少,细胞上清液cTnT含量、CRT及Cyt C蛋白表达降低,MMP水平升高(P ＜0.05,P＜0.01).结论 受损心肌微血管内皮细胞的条件培养液可损伤心肌细胞,其损伤机制可能与CRT介导的线粒体功能受损有关,通心络可抑制该损伤过程.
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通心络干预心肌微血管内皮细胞条件培养液对心肌细胞的保护作用
目的 观察心肌微血管内皮细胞条件培养液对心肌细胞的影响及通心络的干预作用.方法 制备3种心肌微血管内皮细胞条件培养液:正常内皮细胞条件培养液(N-CM),同型半胱氨酸诱导损伤的心肌微血管内皮细胞条件培养液(H-CM)和通心络干预的心肌微血管内皮细胞条件培养液(T-CM).将心肌细胞随机分为4组:正常对照组、N-CM组、T-CM组及H-CM组,采用相应培养液培养.例置显微镜观察心肌细胞形态,酶联免疫吸附法检测细胞上清液心肌肌钙蛋白T( cTnT)含量,JC-1试剂盒测定细胞中线粒体膜电位(MMP),Western blot法检测细胞色素C(Cyt C)和钙网蛋白(CRT)蛋白表达.结果 与正常对照组比较,N-CM组细胞形态无明显变化,细胞上清液cTnT含量、MMP水平、CRT及Cyt C蛋白表达无明显变化(P ＞0.05);与N-CM组比较,H-CM组细胞皱缩,细胞边缘模糊,有大量坏死细胞漂浮,细胞上清液cTnT含量、CRT及Cyt C蛋白表达升高,MMP水平降低(P ＜0.01 );与H-CM组比较,T-CM组细胞无明显皱缩,细胞边缘较清楚,坏死漂浮细胞减少,细胞上清液cTnT含量、CRT及Cyt C蛋白表达降低,MMP水平升高(P＜0.05,P ＜0.01).结论 受损心肌微血管内皮细胞的条件培养液可损伤心肌细胞,其损伤机制可能与CRT介导的线粒体功能受损有关,通心络可抑制该损伤过程.
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大鼠心肌微血管内皮细胞的体外原代培养
目的 体外原代培养大鼠心肌微血管内皮细胞(MMVECs),并观察其生长特性.方法 采用酶蛋白消化法培养大鼠MMVECs,用差速贴壁法和亚细胞克隆法纯化细胞,用第Ⅷ因子相关抗原和CD31相关抗原鉴定细胞,倒置相差显微镜下观察细胞生长状态.结果 成功培养出纯度很高的MMVECs,可用于MMVECs相关实验研究.结论 此原代培养MMVECs的方案具有较好的可操作性和可重复性.
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PI3K/Akt在线粒体ATP敏感性钾通道开放抑制缺氧复氧大鼠心肌微血管内皮细胞FKN表达中的作用
目的 观察PI3 K/Akt信号在线粒体ATP敏感性钾通道(mito-KATP)开放抑制缺氧复氧大鼠心肌微血管内皮细胞(MMECs) fractalkine(FKN)表达中的作用.方法 培养SD大鼠离体MMECs,建立缺氧复氧损伤模型24皿,随机分为4组(n=6):正常对照组(N组)、缺氧/复氧组(H/R组)、二氮嗪预处理+缺氧/复氧组(DZ组)、LY294002+二氮嗪预处理+缺氧/复氧组(LY294002+DZ组).DZ组加入100μmol/L二氮嗪预处理2h,LY294002+ DZ组在加入100 μmol/L LY294002预处理2h后再加入100μmol/L二氮嗪预处理2h,然后和缺氧复氧组同样进行缺氧2h、复氧2h.Hoeehst染色观察凋亡细胞显微结构,四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定细胞活力,RT-PCR检测Akt和FKNmRNA水平,Western blotting检测Akt蛋白水平.结果 与N组比较,H/R组细胞增殖率显著降低(P＜0.01)、凋亡率显著升高(P＜0.01),FKN mRNA和FKN蛋白表达显著增加(P＜0.01)、Akt mRNA和Akt蛋白升高(P＜0.05).与H/R组比较,DZ组细胞增殖率显著升高(P＜0.01)、凋亡率显著降低(P＜0.01),AktmRNA和蛋白显著升高(P＜0.01和P＜0.05),FKN mRNA和蛋白表达显著降低(P＜0.01).与DZ组比较,LY294002+ DZ组Akt mRNA和蛋白显著降低(P＜0.01)、FKN mRNA和蛋白表达显著升高(P＜0.01).结论 mito-KATP开放通过PI3K/Akt信号调节下游FKN mRNA的转录及表达,促使细胞增殖,抑制细胞凋亡,实现对缺氧复氧MMECs损伤的保护.
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白藜芦醇对心肌微血管内皮细胞缺氧/复氧的保护及作用机制
目的 探讨白藜芦醇在抑制缺氧/复氧诱导心肌微血管内皮细胞凋亡中的作用机制.方法 体外培养大鼠心肌微血管内皮细胞,建立细胞缺氧/复氧损伤模型,随机分为正常对照组、缺氧/复氧组(H/R,2 h/4 h)、缺氧/复氧+白藜芦醇组(H/R+ Res).白藜芦醇分别选择5、10、20、30、40 μmol/L浓度,通过TUNEL法检测心肌微血管内皮细胞的凋亡率以确定药物的适浓度,确定适浓度后进行后续实验,分组:正常对照组、缺氧/复氧组(H/R,2 h/4 h)、H/R+白藜芦醇组(适浓度20 μmol/L)、H/R+白藜芦醇(适浓度20 μmol/L)+ LY294002(20 μmol/L)组.MTT比色法检测细胞的增殖能力,Transwell法检测细胞迁移能力,流式细胞仪检测细胞的凋亡率.结果 与缺氧/复氧组(H/R,2 h/4 h)相比,不同浓度的白藜芦醇可抑制细胞凋亡,并呈剂量依赖性,20 μmol/L白藜芦醇组出现明显保护作用(P＜0.01)；LY294002处理后,细胞的增殖及迁移能力明显减弱(P ＜0.05,P＜0.01),细胞凋亡率明显升高(P＜0.01).结论 白藜芦醇可减少缺氧/复氧诱导的心肌微血管内皮细胞凋亡,其机制可能与通过PI3K/Akt信号通路表达有关.
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芪苈强心提取物对缺氧大鼠心肌微血管内皮细胞VEGF及HIF-1α表达作用的研究
目的 观察芪苈强心提取物对缺氧诱导的大鼠心肌微血管内皮细胞VEGF及其上游调控因子HIF-1α表达的影响,探讨芪苈强心胶囊抗心力衰竭作用的相关机制.方法 植块法培养2周龄SD大鼠心肌微血管内皮细胞并鉴定,传代后将第二代细胞随机分为三组:空白对照组,缺氧干预组,缺氧干预+芪苈强心组.干预6h后收集细胞上清,提取细胞核蛋白及胞浆蛋白,利用ELISA,Western Blot 分别检测细胞上清液中VEGF含量及细胞内VEGF上游调控因子HIF-1α的表达.结果 与对照组比较,缺氧干预组心肌微血管内皮细胞VEGF、HIF-1α表达增加,与缺氧干预组比较,芪苈强心干预组VEGF含量均进一步升高,HIF-1α也表现出相同趋势.结论 芪苈强心提取物能够通过促进缺氧状态下心肌微血管内皮细胞HIF-1α诱导的VEGF表达,这可能是芪苈强心发挥抗心力衰竭作用的机制之一.
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血管紧张素Ⅱ引起心肌微血管内皮细胞功能障碍及其可能机制的研究
目的 心肌内血管紧张素系统的激活是心力衰竭发牛发展的重要因素之一,而其具体作用机制尚有许多不明之处.近年来心肌微血管新生障碍在心力衰竭发病中的作用逐渐得到认识.本研究观察了血管紧张素Ⅱ对心肌微血管内皮细胞功能的直接影响,为进一步明确血管紧张素Ⅱ引起心力衰竭的机制提供参考.方法 (1)植块法分离成年Wistar雄性大鼠的心肌微血管内皮细胞,免疫荧光鉴定细胞种类并传代培养;(2)血管紧张素Ⅱ(10-7 -10-6M)干预培养心肌微血管内皮细胞后,分别采用Western blot方法以及PT-PCR的方法,检测不同干预时间点细胞增殖相关蛋白激酶(ERK)的活性变化和细胞死亡相关分子p53的表达变化;(3)血管形成实验检测心肌微血管内皮细胞的功能:血管紧张素Ⅱ干预培养在Matrigel上的微血管内皮细胞后,显微镜下观察形成管腔样结构的能力.结果 (1)植块法培养原代心肌微血管内皮细胞,细胞纯度达95%左右,且具有形成管腔样结构的能力;(2)在血管紧张素Ⅱ干预心肌微血管内皮细胞10分钟时,ERK的磷酸化水平明显升高,与非干预组相比具有统计学差异(P＜0.05);(3)血管紧张素Ⅱ干预心肌微血管内皮细胞30min,虽然与非干预组相比没有统计学差异,但p53 mRNA表达增加;(4)用血管紧张素Ⅱ持续干预18h,心肌微血管内皮细胞形成管腔样结构的数量明显减少,与非干预组相比具有统计学差异(P＜0.01);单纯血管紧张素Ⅱ持续干预18小时组与前处置10分钟后再干预18小时组相比,心肌微血管内皮细胞形成管腔样结构的数鼍明显减少、或基本上不形成管腔样结构,两组相比具有统计学差异(P＜0.05).结论 持续血管紧张素Ⅱ干预明显降低培养心肌微血管内皮细胞形成管腔样结构的完整性及其数量,其机制可能与增加p53的表达有关;短期血管紧张素Ⅱ前处置培养心肌微血管内皮细胞明显改善持续血管紧张素Ⅱ干预后细胞形成管腔样结构能力的下降,其机制可能与短期升高细胞内蛋白激酶ERK的活性进而起到细胞保护作用有关.
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促红细胞生成素衍生肽抑制大鼠心肌微血管内皮细胞缺血再灌注损伤的作用研究
目的：探讨促红细胞生成素衍生肽（HBSP）抑制大鼠心肌微血管内皮细胞（CMECs）缺血/再灌注损伤的作用及其机制。
方法：分离培养大鼠CMECs，建立缺血/再灌注损伤模型，随机分为对照组、模拟缺血/再灌注组（SI/R组）、SI/R＋重组人促红细胞生成素组（SI/R+rhEPO组）、SI/R＋HBSP组；HBSP分别选择2.5 ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml四个浓度，通过噻唑蓝（MTT）比色实验检测CMECs增殖能力以确定药物作用的适浓度。而后采用细胞划痕实验检测细胞迁移能力，末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口末端标记测定（TUNEL）法检测细胞凋亡率来进一步验证其保护作用。研究保护机制的实验分组为：对照组、SI/R组、SI/R＋HBSP（HBSP适浓度为25 ng/ml）组、SI/R+HBSP+磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）抑制剂（LY294002）组、SI/R+HBSP+雷帕霉素组，采用蛋白免疫印迹（Western blot）法检测蛋白激酶B（AKT）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、核糖体S6蛋白激酶（p70S6K）等蛋白的表达及其磷酸化水平。
结果：与SI/R组比，SI/R+rhEPO组和SI/R+HBSP组CMECs增殖能力明显上升（P<0.05），凋亡率显著下降（P<0.01），迁移能力增强。用抑制剂LY294002及雷帕霉素处理后，与SI/R组相比，SI/R+HBSP组AKT、mTOR及p70S6K的磷酸化水平均显著提高（P<0.05）；与SI/R+HBSP组相比，SI/R+HBSP+LY294002组的AKT、mTOR及p70S6K的磷酸化水平均显著下降（P<0.05），SI/R+HBSP+雷帕霉素组mTOR磷酸化水平及p70S6K磷酸化水平显著下降（P<0.05）。
结论：HBSP能够抑制缺血/再灌注诱导的CMECs的损伤，其保护作用可能与PI3K-AKT/mTOR信号通路激活有关。关键词： 促红细胞生成素衍生肽 心肌微血管内皮细胞 缺血/再灌注损伤 细胞凋亡 -
通心络对同型半胱氨酸诱导大鼠心肌微血管内皮细胞损伤的干预作用及氧化应激机制研究
目的：探讨通心络对同型半胱氨酸诱导大鼠心肌微血管内皮细胞损伤的干预作用及氧化应激机制。方法：采用植块法原代培养大鼠心肌微血管内皮细胞，倒置显微镜观察细胞形态并通过CD31免疫荧光法对培养的大鼠心肌微血管内皮细胞进行辨别、鉴定。用同型半胱氨酸（Hcy）建立细胞损伤模型，实验分为对照组、同型半胱氨酸组、通心络低浓度组、通心络中浓度组、通心络高浓度组。分别检测各组细胞的存活率、细胞上清液中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量、细胞内活性氧（ROS）水平、内皮素-1（ET-1）和内皮型一氧化氮合酶（eNOS）表达水平的变化。结果：与对照组相比，同型半胱氨酸组细胞存活率降低[（74.61±2.88）% vs（100.00±2.07）%]，细胞上清液中MDA含量升高[（4.10±0.18）nmol/ml vs（1.92±0.10）nmol/ml]，SOD活性降低[（7.55±0.71）U/ml vs（20.77±0.68） U/ml]，细胞内ROS水平升高[（38.17±10.28）% vs（19.83±2.97）%]，ET-1 mRNA表达上调，eNOS蛋白表达下调；与同型半胱氨酸组相比，通心络各剂量组均能不同程度的改善上述指标变化。结论：通心络能够改善同型半胱氨酸诱导的大鼠心肌微血管内皮细胞的功能损伤，并通过减轻氧化应激损伤发挥细胞保护作用。
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去天门冬氨酸血管紧张素Ⅰ减轻大鼠心肌微血管内皮细胞缺血/再灌注损伤
目的 探讨去天门冬氨酸血管紧张素Ⅰ (DAA-Ⅰ)对大鼠心肌微血管内皮细胞(CMECs)缺血/再灌注损伤的影响.方法 分离培养大鼠CMECs,建立模拟缺血/再灌注模型,完全随机分组,分为对照组、模拟缺血/再灌注组(SI/R组)、模拟缺血/再灌注+DAA-Ⅰ (2.5、3.75、5.0μmol/L)组.MTT检测细胞增殖能力,细胞划痕实验检测细胞迁移能力,TUNEL法检测细胞凋亡,采用Western blot检测GRP78/Bip、CHOP/GADD153、pro-caspase-12、cleaved-caspase-12蛋白的表达.结果 与对照组相比较,SI/R组CMECs增殖能力明显降低(P＜0.01),凋亡率显著上升(24.85％±0.67％比3.55％ ±0.11％,P＜0.01).与SI/R组相比,SI/R+DAA-Ⅰ组细胞增殖能力明显升高(P＜0.01)并呈剂量依赖性,细胞迁移率上升(P＜0.01)并呈剂量依赖性,凋亡率明显下降(15.18％±0.40％比24.85％ ±0.67％,P＜0.01)并呈剂量依赖性.与对照组相比较,SI/R组和SI/R+DAA-Ⅰ组的GRP78、CHOP/GADD153、cleaved-caspase-12表达明显上升(均为P＜0.01).与SI/R组相比,SI/R+DAA-Ⅰ组的GRP78、CHOP/GADD153、cleaved-caspase-12表达明显降低(均为P＜0.01).结论 DAA-Ⅰ可显著抑制缺血/再灌注损伤诱导的CMECs凋亡,促进CMECs存活,改善细胞功能,其保护作用可能与下调ERS相关蛋白的表达有关.
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艾塞那肽通过抑制黄嘌呤氧化酶-活性氧类降低内皮细胞缺氧复氧损伤
目的 探究原代心肌微血管内皮细胞(CMEC)在缺氧复氧损伤(H/R)模型条件下的损伤信号通路,以及艾塞那肽(Exe)的保护机制.方法 双酶消化法体外分离培养SD大鼠CMEC,CD31和Ⅷ因子鉴定纯度.建立H/R模型并筛选Exe的佳干预浓度.Fluo-3AM荧光探针检测H/R条件下胞内Ca2+变化.Western blotting检测黄嘌呤氧化酶(XO)表达量.DCFH-DA标记的活性氧探针检测胞内活性氧类(ROS)水平.共聚焦显微镜观察JC-1染色和细胞色素-C(Cyt-C)释放.予以Exe干预和使用小干扰RNA(siRNA)干扰技术抑制XO的表达,同步观察各指标变化情况.计量资料以均数±标准差(±s)表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析.结果 10 nmol/L为Exe的佳抗凋亡浓度.H/R导致胞浆内Ca2+荧光强度和Ca2+依赖的XO表达量升高,予以Exe处理可显著降低Ca2+荧光(P<0.05).予以Exe处理或使用siRNA干扰技术可显著抑制XO的表达、降低XO-ROS生成、降低H/R损伤造成的线粒体膜电位、减少Cyt-C的释放,并伴随caspase-3和caspase-9活性的降低(P<0.05).结论 H/R通过激活Ca2+-XO-ROS损伤信号通路,导致CMEC的线粒体结构功能障碍,终诱导细胞凋亡;而予以Exe处理可通过抑制上述信号通路保护CMEC,降低H/R模型引起的细胞凋亡.
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阿托伐他汀保护高糖环境下心肌微血管内皮细胞损伤的机制研究
目的 观察阿托伐他汀对高糖环境下心肌微血管内皮细胞损伤的作用,并探讨其机制.方法 培养SD大鼠心肌微血管内皮细胞,将细胞分成对照组、高血糖组、单纯阿托伐他汀处理组、阿托伐他汀+高糖组,使用超化物测定试剂盒检测自由基(RO S)水平,以末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(TUNEL)检测细胞凋亡.利用短RNA干扰(siRNA)技术,下调内皮细胞蛋白激酶B1(Akt1)和β1-整合素(β1-Integrin)的表达,采用Western blot检测小GTP结合蛋白解离刺激物(SmgGDS)表达水平.结果 (1)高糖组ROS水平高于对照组(t=4.154,P<0.01),阿托伐他汀组和阿托伐他汀+高糖组ROS水平均低于高糖组(t=4.233和2.893,均P<0.05).(2)高葡萄糖组细胞凋亡比例高于对照组(t=4.058,P<0.01),阿托伐他汀组和阿托伐他汀+高糖组细胞凋亡比例均低于高葡萄糖组(t=4.157和2.601,均P<0.05).(3)转染Akt1-siRNA后,与模拟组相比,高糖组和高糖+阿托伐他汀组的Akt1的表达水平均降低(t=4.058和4.167,均P<0.01);转染β1-integrin-siRNA后,与模拟组相比,高糖组和高糖+阿托伐他汀组的β1-integrin的表达水平均降低(t=4.073和4.215,均P<0.01).(4)阿托伐他汀低剂量组(1μmol/L)和阿托伐他汀高剂量组(10μmol/L)心肌微血管内皮细胞的SmgGDS相对表达水平均高于对照组(t=2.671和2.832,均P<0.05),高剂量组的SmgGDS相对表达水平高于低剂量组(t=2.612,P<0.05);转染Akt1-siRNA后,高糖组和高糖+阿托伐他汀组的SmgGDS表达水平均降低,高糖+阿托伐他汀+模拟组的SmgGDS表达水平高于高糖+模拟组(t=4.051,P<0.01);转染β1-integrin-siRNA后,高糖组和高糖+阿托伐他汀组的SmgGDS表达水平均低于高糖+阿托伐他汀+模拟组,高糖+阿托伐他汀+模拟组的SmgGDS表达水平高于高糖+模拟组(t=4.068,P<0.01);高糖组和高糖+阿托伐他汀组Akt磷酸化随时间变化的表达水平显示10 min后,高糖+阿托伐他汀组Akt磷酸化表达水平高于5 min后(t=2.608,P<0.05),15 min后Akt磷酸化表达水平高于10 min后(t=3.127,P<0.05);β1-integrin-siRNA转染高糖组,与高糖+模拟组比较,p-Akt/t-Akt降低(t=3.371,P<0.05).结论 阿托伐他汀可以保护高糖环境下心肌微血管内皮细胞免受氧化应激和凋亡,这种保护作用部分可能是通过他汀依赖的β1-Integrin/Akt1途径,上调SmgGDS实现的.
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缺氧条件下GDF-15对心肌微血管内皮细胞成管的影响
目的 通过缺氧发生装置将心肌微血管内皮细胞(CMECs)进行缺氧,转染GDF-15相关病毒,观察其对CMECs成管的影响.方法 将CMECs分为五组:空白对照组、GDF-15siRNA转染组、干扰对照组、过表达GDF-15组、过表达对照组,以上各组在缺氧发生装置中进行缺氧干预,Western blot测定各组细胞GDF-15蛋白的表达情况.通过内皮细胞成管实验,观察各组在缺氧条件下CMECs管腔结构形成情况.结果 过表达组较其他组GDF-15蛋白表达明显增加,干扰组明显降低,缺氧条件较常氧,CDF-15表达增高.缺氧6h时CMECs过表达GDF-15组在Matrigel Matrix上形成管腔结构,而GDF-15siRNA转染组及对照组均未形成管腔结构.结论 缺氧条件能促进CMECs中GDF-15的表达,GDF-15能够促进CMECs增殖及血管新生,为GDF-15在急性心肌梗死侧支循环方面的研究奠定了基础.
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大鼠心肌微血管内皮细胞缺氧模型的建立
目的 对大鼠的心肌微血管内皮细胞(myocardial microvascular endothelial cells,MMVECs)离体培养方法进行改良,建立该细胞的缺氧模型.方法 取出7日龄左右的Wistar大鼠的心脏,用胰蛋白酶和胶原酶二次消化法获得MMVECs,密度梯度离心法纯化细胞,计算细胞纯度;用免疫细胞化学方法检测微血管内皮细胞特异性第Ⅷ因子、CD34及CD31相关抗原;将原代培养的细胞置于持续通人体积分数为1％O2、5％ CO2和94％N2的自制缺氧装置中,并在37℃孵箱中分别缺氧处理4、6、12、18、24h,各时间段均设置正常对照组;用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色实验检测缺氧对大鼠MMEVCs增值活力的影响,Hoechst33342染色观察缺氧诱导该细胞凋亡形态学变化.结果 细胞形态特征及相关抗原检测证实:与仅用二次消化法培养细胞相比,密度梯度离心纯化后所得MMVECs纯度提高(P＜0.01);MTT比色实验:随着培养时间的延长,与正常对照组相比,各缺氧组OD值均有所降低,其中缺氧12、18和24h的OD值降低显著(P均＜0.01);从缺氧12h开始,各缺氧组的OD值逐渐降低,与12h相比均有显著差异(P＜0.01或P＜0.05);Hoechst33342染色:缺氧12h细胞开始出现核固缩、碎裂、蓝色浓染等典型的凋亡形态学变化,随着缺氧时间延长该变化更为明显.结论 该原代离体培养方法可以获得纯度较高的MMVECs;缺氧对MMVECs的增殖有抑制作用,本方法可以简便、有效地建立MMVECs的缺氧模型.
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化橘红有效成分柚皮苷对高糖诱导CMECs凋亡的抑制作用
目的 观察化橘红有效成分柚皮苷(Naringin)对高糖诱导心肌微血管内皮细胞(CMECs)凋亡的影响,探讨Naringin对CMECs损伤的保护作用及可能的机制.方法 CMECs系分为正常糖组、高糖组、高糖+Naringin (50、100、200 μmol/L)处理组.Western印迹法检测CMECs p38丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)(p38)、凋亡相关蛋白Caspase9的表达及其活性;荧光探针JC-1观察线粒体膜电位.结果 ①高糖刺激CMECs p38 MAPK信号通路的激活,p38蛋白表达明显上调,正常糖对照组仅有少量p38蛋白表达;高糖+Naringin(50、100、200μg/ml)组p38蛋白表达量较高糖组明显下降(P＜0.05).②高糖培养诱导CMECs48h后可见Caspase9的表达及其活性明显增加,与正常糖组比较差异有统计学意义(P＜0.05),相应CMECs线粒体膜电位降低;naringin(50、100、200 μmol/L)预处理CMECs,明显抑制高糖诱导的CMECs Caspase 9表达及其活性,差异均有统计学意义(P＜0.05),抑制率分别是50％、64％、68％和54％、65％、68％;CMECs线粒体膜电位也不同程度降低.结论 化橘红有效成分Naringin(50、100、200 μmol/L)能够减少高糖诱导的CMECs凋亡,可能与其抑制p38 MAPK活化相关,并呈一定浓度依赖性.
关键词： 心肌微血管内皮细胞 凋亡 p38丝裂原活化蛋白激酶 柚皮苷 高糖 -
体外培养大鼠心肌微血管内皮细胞缺氧模型的建立
目的 建立大鼠心肌微血管内皮细胞(CMECs)缺氧模型.方法 植块法培养CMECs,免疫细胞化学鉴定微血管内皮细胞特异性标志.将原代培养的CMECs在1%O2-94%N2-5%CO2低氧气体环境中培养24 h制备低氧损伤模型(L组),以无血清常氧培养作为对照组(N组).倒置相差显微镜观察缺氧前后细胞形态变化,MTT法测定细胞活力,Annexin V-FITC和PI双标记法测定细胞凋亡率.结果 植块法培养的大鼠CMECs具备典型微血管内皮细胞特征;Ⅷ因子、CD31相关抗原免疫染色鉴定均阳性.缺氧前后细胞形态无明显变化;与N组比较,L组细胞活力明显增加(P＜0.05);细胞凋亡率明显降低(P＜0.05),其中早期凋亡降低明显(P＜0.01).结论 本方法可以成功建立简便、易行的CMECs细胞缺氧模型.
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二氮嗪预处理缺氧复氧大鼠心肌微血管内皮细胞PI3K、Akt、FKN mRNA的表达
背景:在缺氧复氧早期,促使心肌微血管内皮细胞增殖的措施,涉及一系列相关基因的改变和受多种基因调控.目的:观察二氮嗪预处理对缺氧复氧大鼠心肌微血管内皮细胞增殖和PI3K、Akt和FKN mRNA表达的影响.方法:培养SD大鼠心肌微血管内皮细胞,按照不同的干预方式将细胞随机均分为正常对照组、缺氧/复氧组、二氮嗪组、二氮嗪+阻断剂组.观察凋亡细胞形态、活力及PI3K、Akt和FKN mRNA转录水平.结果与结论:与正常对照组比较,缺氧/复氧组细胞增殖率显著降低、Akt和FKN显著升高(P < 0.01).与缺氧/复氧组比较,二氮嗪组细胞增殖率显著升高(P < 0.05);PI3K和Akt 显著升高、FKN显著降低(P < 0.01).二氮嗪+阻断剂组取消了二氮嗪的作用,与缺氧/复氧组比较差异无显著性意义.说明二氮嗪预处理通过促使细胞增殖,上调PI3K、Akt mRNA表达、下调FKN mRNA表达而实现对缺氧复氧心肌微血管内皮细胞损伤的保护.
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低频脉冲磁场对大鼠心肌微血管内皮细胞增殖和缝隙连接蛋白43表达的影响
目的 探讨低频磁场对大鼠心肌微血管内皮细胞(CMECs)增殖和缝隙连接蛋白43(Cx43)表达的影响.方法 设不同照射强度为照射组,不加磁场干预为对照组.照射条件:磁场频率为15 Hz,强度分别为0.8 mT、1.4 mT、1.8 mT,照射时间为4 h/d,连续照射4d.应用MTT法检测CMECs增殖,采用Western印迹检测Cx43蛋白表达.结果 细胞生长结果显示,磁场能够促进CMECs增殖.1.4 mT组照射第2天后CMECs生长速度加快,在第3天开始进入对数生长期,在第4天生长为旺盛,之后进入生长平台期,第2～7天与对照组比较有显著性差异(P＜0.05),而且细胞生长峰期曲线明显前移并且峰值增高.1.4 mT组、1.8 mT组CMECs增殖与对照组比较显著升高(t=14.771、16.247,P ＜0.05).CMECs增殖在1.4 mT组和1.8mT组差异无统计学意义(t=1.692,P＞0.05).0.8 mT组CMECs增殖与对照组无统计学意义(t=1.771、P＞0.05).磁场照射后Cx43表达明显下调,0.8mT、1.4mT、1.8mT组与对照组差异有统计学意义(t=2.244、5.780、6.165,P＜0.05),而1.4mT组和1.8mT组Cx43蛋白的表达下调更为明显,与0.8 mT组差异显著(t=3.768、4.195,P＜0.05).而Cx43蛋白的表达在1.4 mT组和1.8 mT组差异无统计学意义(t=0.462,P ＞0.05).结论 低频脉冲磁场能促进CMECs增殖和增强细胞活力,下调Cx43表达,其在分子水平上的可能作用机制表现为对Cx43的有效调控.
