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耐辐射奇球菌PprI蛋白质在毕赤酵母菌中的高效表达及纯化
目的 利用真核毕赤酵母高效表达原核的耐辐射奇球菌pprI基因,建立高效表达及纯化PprI蛋白质的技术路线.方法 根据毕赤酵母密码子的偏爱性,改造耐辐射奇球菌pprI基因的编码序列,利用PCR技术全合成改造过的pprI基因,并在其N末端添加一个6×His标签.PCR产物经纯化后克隆到毕赤酵母表达载体pHBM-905A中,利用Cop 1和Not I双酶切并回收线性化的目的片段后,转化毕赤酵母GS115菌株.将获得的毕赤酵母转化子诱导表达,SDS-PAGE、Western blot和质谱检测培养上清液,用Ni-NTA柱纯化目的蛋白,BCA法测定蛋白浓度.结果 新合成的耐辐射奇球菌pprI基因编码序列正确,毕赤酵母转化菌株的培养上清液经SDS-PAGE和Western blot均可检测到相对分子质量为43 000的目的蛋白条带,经质谱检测证实该目的蛋白为耐辐射奇球菌PprI蛋白.选用Ni-NTA柱获得了大量纯化的PprI蛋白,应用浓度为250 mmol/L的咪唑淋洗时,PprI蛋白洗脱率高.BCA法测得纯化蛋白浓度为0.35 mg/ml.结论 建立了一种新的适于毕赤酵母表达的耐辐射奇球菌pprI基因,成功构建了分泌表达Pprl蛋白质的重组毕赤酵母工程菌株,建立了高效表达目的蛋白的技术路线,并获得了高效表达和纯化的PprI蛋白.
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原核pprI基因活体转染对BALB/c小鼠急性放射损伤保护作用的研究
目的 研究耐辐射奇球菌pprI基因活体转染对小鼠急性放射损伤的防护作用.方法 采用SPF级纯品系BALB/c雄性小鼠,应用活体电转染技术,将pEGFP-c1空载质粒及pEGFP-c1-pprI基因重组质粒转入小鼠股前肌肉.应用60Coγ射线进行全身照射,死亡率观察组吸收剂量为6 Gy,观察照后30 d内小鼠死亡率的变化;放射效应观察组吸收剂量为4 Gy,于照后1、7、14、28和35 d观察小鼠外周血象、胸腺、脾脏和骨髓细胞的凋亡率,并于照后第7和28天观察小鼠肺脏和睾丸组织的病理变化.结果 质粒注射剂量为50 μg/50μl,电场强度为200 V/cm时转染肌细胞的效率高.pEGFP-c1-pprI基因重组质粒转染组小鼠急性辐射死亡率为30％,显著低于单纯照射组(60.0％)和空载体组(63.3％)(x2=4.90、6.24,P＜0.05).与单纯照射组、空载体组比较,pEGFP-c1-pprI基因重组质粒转染组小鼠的外周血白细胞计数在照后1、7、14和28 d显著增高(F=16.26、8.10、6.37、10.74,P＜0.05),血小板计数在照后第7和14天显著增高(F=7.36、5.71,P＜0.05),淋巴细胞百分率在照后7d显著增高(F=18.43,P＜0.05);胸腺和骨髓细胞凋亡率均在照后第1、7、14、28和35天显著降低(F=3.88、14.91、14.14、39.86、5.65,P＜0.05;F=53.70、11.75、21.78、41.40、4.54,P＜0.05);脾脏细胞凋亡率在照后第1、7、14和28天显著降低(F=97.95、56.61、33.55、14.71,P＜0.05).pEGFP-c1-pprI基因重组质粒转染组小鼠肺脏和睾丸的放射病理损伤较轻并且恢复较快.结论 耐辐射奇球菌pprI基因活体电转染对BALB/c小鼠急性放射损伤具有显著的保护作用,为进一步临床应用奠定了实验基础.
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耐辐射奇球菌recF和recO基因的克隆表达与功能验证
目的 构建耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans,Dr)recF和recO基因的原核表达重组子并在E.coli BL21(DE3)中表达,检测RecO和RecF蛋白能否提高Ecoli BL21(DE3)对紫外线辐射的抵抗能力.方法 采用PCR扩增Dr菌基因组中recF和recO基因片段,以质粒pET30b(+)为基础,构建重组质粒pET30b(+)-recF和pET30b(+)-recO,并转化到E.coliBL21(DE3)中,LPTG诱导重组RecF和RecO蛋白表达,表达产物采用SDS-PAGE鉴定;计算紫外辐照前后各组细菌生存率变化.结果 构建了pET30b(+)-recF和pET30b(+)-recO重组载体,经IPTG诱导后能在E.coli BL21(DE3)中表达RecF和RecO蛋白.结论 构建了原核表达重组质粒pET30b(+)-recF和pET30b(+)-recO,实现RecF和RecO在原核细胞中的表达,体外实验证明Rec0和RecF蛋白能提高E.coli BL21(DE3)对紫外线辐射的抵抗能力.
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耐辐射奇球菌抗辐射小分子化合物研究进展
耐辐射奇球菌作为世界上“抗性强”的细菌,能够在强辐射、严寒、干旱和酸性环境中继续生存.耐辐射奇球菌之所以对射线及干旱等恶劣环境有较强的抗性,与其自身的生物学结构及功能有关,相关研究报道了其超强的DNA损失修复机制以及蛋白质损伤修复及清除能力.早期研究发现类胡萝卜素是其抗辐射、抗紫外线作用的一种小分子,近期发现锰离子络合物在其抗辐射作用中发挥了重要作用.该文将对耐辐射奇球菌中与抗辐射有关的小分子物质进行综述,以期为开发抗辐射、抗氧化先导化合物提供思路.
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耐辐射奇球菌中多效蛋白PprA功能的研究进展
耐辐射奇球菌(DR)是研究辐射抗性的模式生物,PprA蛋白(pleiotropic protein promoting DNA repair)是DR中一种特有的、促进DNA修复的多效蛋白.笔者对PprA蛋白在DNA损伤修复和维持基因组稳定性等方面的功能进行了综述,另通过运用生物信息学方法预测其结构域及与PprA蛋白相互作用的蛋白,进一步了解其发挥作用的机制和途径.
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耐辐射奇球菌pprM基因在真核细胞中的表达
目的 扩增耐辐射奇球菌辐射抗性基因pprM,构建pEGFP-C 1-pprM重组载体,转入293T细胞并表达PprM蛋白,为研究原核细胞辐射抗性基因pprM是否提高真核细胞的辐射抗性及其可能存在的作用机制奠定实验基础.方法 以无任何突变的pGEX-6p-1-pp rM重组质粒为模版,设计引物PCR扩增pprM基因,利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收目的片段,EcoRI、BamHI双酶切回收的目的片段及质粒pEGFP-C1,将双酶切产物进行连接,连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞后涂布于含卡那霉素(Kan)抗性的Luria-Bertani(LB)固体培养基上进行筛选,所筛选的阳性克隆进一步用菌落PCR,EcoR I、BamHI双酶切及测序鉴定.通过Lipofectamine2000转染试剂将pEGFP-C 1-pprM重组质粒转入293T细胞,倒置荧光显微镜观察绿色荧光融合蛋白的表达.裂解细胞抽提蛋白,Western blot进一步验证PprM蛋白的表达.结果 菌落PCR结果及双酶切结果显示,在400 bp左右处有一条明显的目的条带,测序结果显示碱基序列与原基因序列一致,载体构建成功.荧光拍照结果显示,pEGFP-C 1-pprM重组质粒成功转染293T细胞并表达绿色荧光融合蛋白;Western blot结果显示在40×103处有融合蛋白表达.结论 笔者成功将所构pEGFP-C 1-pprM重组质粒转入293T细胞,并表达相应蛋白,为后续实验研究原核基因pprM及其产物对真核细胞辐射抗性的影响奠定了良好的实验基础.
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耐辐射奇球菌基因组DNA表达文库的构建与鉴定
目的:构建耐辐射奇球茵(Dcinoeoccus radiodurans R1)基因组DNA表达文库,为进一步研究耐辐射奇球茵高抗辐射的调控网络奠定基础.方法:提取耐辐射奇球菌基因组DNA,用Sau3AI酶将基因组DNA部分酶切成0.5-5 kb大小的片段,用T4DNA连接酶将部分酶切片段与经BamH I和碱性磷酸酶(CIAP)处理的pGADT7栽体进行连接后电击转化大肠杆菌DH5a.结果:得到重组子数为2.2×104,扩增后的文库滴度为108 cfu/mL.结论:构建了耐辐射奇球菌基因组pGADT7表达文库,为进一步筛选与高抗辐射相关基因产物的互作蛋白奠定了基础.
关键词： 耐辐射奇球菌 基因组DNA表达文库 酵母双杂交系统 -
耐辐射球菌基因组DNA酶切条件的优化
目的 研究耐辐射奇球菌Deinococcus radiodurans R1基因组DNA酶切的优化条件,从而获得构建基因文库所需的DNA片段,旨在构建DR菌基因组DNA表达文库,进一步筛选文库中与其有相互作用的蛋白. 方法 培养耐辐射奇球菌,提取基因组DNA,用Sau3AI酶切DR菌基因组DNA,分别从酶浓度、酶切时间等选择酶切产生的DNA片段集中在0.5～5.0 kb的佳条件,后通过琼脂糖凝胶电泳进行检测. 结果 Sau3AI 酶切DR菌基因组DNA的佳酶浓度为0.125 u/10 μL,佳作用时间为3 h,此条件下DR菌基因组DNA片段主要集中于0.5～5.0 kb. 结论 优化了DR菌基因组DNA的酶切条件,为进一步构建DR菌基因组DNA表达文库,筛选与高抗辐射相关基因产物的互作蛋白奠定了基础.
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耐辐射奇球菌超氧化物歧化酶基因的克隆和表达
目的构建耐辐射奇球菌(D.radiodurans)锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)基因的原核表达重组子,并在E.coli BL21(DE3)中表达.方法用PCR方法自D.radiodurans基因组中扩增Mn-SOD目的片段.将该基因与原核表达质粒载体pET-30a(+)连接,构建重组质粒pET-SOD,并转化表达宿主菌E.coli BL21(DE3).用异丙基硫代-βD-半乳糖苷(IPTG)诱导重组SOD蛋白表达,SDS-PAGE分析表达产物.结果获得了D.radioduransMn-SOD基因的pET原核表达重组质粒,该质粒经IPTG诱导能在E.coli BL21(DE3)中高效表达目的蛋白,蛋白活性可达51 800 U/g湿菌体.结论成功构建了原核表达重组质粒pET-SOD,实现了SOD在原核细胞中的高效表达,表达产物活性较高,为重组D.radiodurans Mn-SOD的进一步研究和应用奠定了基础.
