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Exendin-4与绿色荧光蛋白融合基因的表达与活性研究
目的:表达具有双功能特性的Exendin-4-GFP融合蛋白.方法:构建融合表达载体pET21a(+)/Exendin-4-GFP,转化大肠杆菌BL21后,以IPTG诱导融合蛋白的表达,并利用镍金属螯合层析树脂对其进行纯化.采用胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)转染的CHO细胞考察融合蛋白的结合特性,并检测其生物活性.结果:含有融合表达载体的重组菌株诱导表达后,经SDS-PAGE及免疫印迹分析显示,31.0 ku的融合蛋白在大肠杆菌中得到了表达,且具有Exendin-4的抗原活性.受体结合实验表明,该融合蛋白能够与GLP-1R特异性结合,在488 nm激发光下呈现绿色荧光.体内活性实验表明,融合蛋白具有明显的降血糖活性.结论:本研究表达的Exendin-4-GFP融合蛋白同时具有Exendin-4的活性和荧光特性,为研究GLP-1受体功能以及Exendin-4与细胞相互作用的机制奠定了基础.
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基因重组hVEGF165腺相关病毒载体的包装和鉴定
目的:采用rAAV Helper free System构建hVEGF165腺相关病毒和增强型绿色荧光蛋白腺相关病毒,并初步鉴定其感染情况.方法:采用AAV-Helper free system包装系,构建hVEGF165腺相关病毒和增强型绿色荧光蛋白腺相关病毒载体质粒.应用电穿孔方法质粒共转染HEK293细胞,分离纯化后获得rAAV-hVEGF165和rAAV-EGFP,AVSachTM ELISA法测定rAAV颗粒滴度,并鉴定其对HEK293细胞的感染情况.结果:包装纯化后获得病毒滴度可达到2×1011,电镜观察病毒颗粒均匀,病毒大小20-25 nm,呈多面体形态.结论:成功包装hVEGF165腺相关病毒和增强型绿色荧光蛋白腺相关病毒.
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脑缺血再灌注损伤后BMSCs不同示踪方式的比较
目的：比较脑缺血再灌注损伤后，不同示踪方式观察骨髓间充质干细胞（BMSCs）移植后的效果。方法BMSCs复苏培养后，分别采用5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）、PKH26进行标记，并且与绿色荧光蛋白（GFP）转染细胞，分别对脑缺血再灌注模型大鼠脑组织进行移植。将75只SPF级雄性SD大鼠随机均分为假手术组，模型组，BrdU、PKH26、GFP示踪组。采用线栓改良法制备大鼠左侧大脑中动脉局灶性脑缺血再灌注损伤模型。脑缺血再灌注24 h后，假手术组、模型组分别采用脑立体定位仪经脑实质植入10μL生理盐水；BrdU、PKH26、GFP示踪组分别植入10μL的BMSCs/BrdU、BMSCs/PKH26、BMSCs/GFP。采用神经行为学评分、TTC染色、脑组织含水量法进行模型鉴定及疗效判定，采用焦油紫染色进行神经元计数，并在荧光显微镜下计数标记细胞阳性率。结果移植前细胞BrdU、PKH26、GFP标记率无明显差异。移植4周后3示踪组大鼠神经行为学评分、脑梗死体积、脑组织含水量均显著低于模型组，神经元计数显著高于模型组；神经行为学评分、脑梗死体积高于假手术组，脑组织含水量、神经元计数与假手术组差异无统计学意义；3示踪组间上述指标差异均无统计学意义。GFP示踪组的荧光标记细胞阳性率高于BrdU、PKH26示踪组。结论脑缺血再灌注损伤中，GFP示踪方式效果更为持久，优于BrdU和PKH26。
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VEGF165在恒河猴骨髓间充质干细胞中的表达及鉴定
目的：探讨血管内皮生长因子（VEGF165）转染恒河猴间充质干细胞（MSCs）后的表达情况，以及转染后对MSCs功能的影响。方法通过Ficoll法分离并培养恒河猴骨髓MSCs，进行细胞表型鉴定。转染pcDNA-eGFP-VEGF165至MSCs，荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白（eGFP）表达情况，同时流式细胞技术对转染成功的细胞进行细胞表型及eGFP表达鉴定，RT-PCR法检测转染后VEGF165表达情况。结果成功分离到纯度较高的MSCs，转染后的MSCs及子代细胞均有eGFP和VEGF165的表达，且保留了MSCs的特性。结论 VEGF165基因转染MSCs后可以稳定表达外源基因，且可以维持MSCs的特性。
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hnRNP A1的增强型绿色荧光标记及细胞应激定位分析
目的：构建包含有核不均一核糖核蛋白（hnRNP）A1蛋白编码区序列的真核表达质粒pEGFP-C1-hnRNP A1，并对增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标记的hnRNP A1蛋白进行细胞应激共定位分析。方法提取HeLa细胞总RNA，以针对hnRNPA1-3′非翻译区的特异性片段为反转录引物，反转录出包含hnRNP A1编码区序列的cDNA，并以其为模板，降落PCR法扩增出带EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切位点的目的基因，利用双酶切法分别酶切目的基因片段和线性pEGFP-C1，在T4-DNA连接酶的催化下将两者连接构建成pEGFP-C1-hnRNP A1重组质粒，然后将重组质粒转染入HeLa细胞内，以激光共聚焦荧光显微镜观察EGFP-hnRNP A1的荧光表达情况，Western印迹法检测EGFP与hnRNP A1的融合表达情况，后进行细胞原位杂交及细胞免疫荧光检测在氧化应激状态下EGFP-hnRNP A1蛋白与poly(A)+mRNA（应激颗粒的标记成分）及DPC1a（加工体的标记蛋白）的应激共定位。结果以单/双酶切及基因测序法鉴定构建的重组质粒无误，激光共聚焦荧光显微镜观察和Western印迹结果检测到绿色荧光融合蛋白的表达；EGFP-hnRNP A1蛋白与poly(A)+mRNA呈现共定位，但与DPC1a无共定位关系。结论重组pEGFP-C1-hnRNP A1质粒成功构建并表达，应激状态下EGFP标记的hnRNP A1参与应激颗粒的构成。
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携带EGFP基因的人肝细胞生长因子基因慢病毒表达载体的构建
目的 构建携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的人肝细胞生长因子(HGF)基因慢病毒表达载体.方法 以pUC-SRα/HGF载体为模板,利用PCR体系扩增获得两端带有attB重组位点的HGF基因编码序列,并通过BP反应将其克隆至入门载体pDONRTM221的多克隆位点内以构建入门载体pDown-HGF.通过LR反应将pDown-HGF、pUp-EF1α、pTail-IRES/EGFP与目的载体pLV.Des3d.P/neo连接,得到慢病毒表达载体pLVneo/EF1 α-HGF-IRES-EGFP.并进行PCR鉴定和DNA测序.随后,通过脂质体将该重组载体与慢病毒包装系统共转染293FT细胞,空斑法测定病毒滴度.结果 PCR及DNA测序结果证实pLVneo/EF1α-HGF-IRES-EGFP中HGF基因目的片段插入位置和序列正确.转染pLVneo/EF1 α-HGF-IRES-EGFP后的293FT细胞在荧光显微镜下观察可见强绿色荧光.包装的慢病毒液滴度为7.9×107 TU/ml.结论 成功构建了携带EGFP基因的人HGF基因慢病毒表达载体.
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绿色荧光蛋白和胰岛素基因共表达重组腺病毒载体的构建及感染人脐带间充质干细胞的实验研究
目的 构建同时表达绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因和人胰岛素(insulin,INS)基因的重组腺病毒载体pAdxsi-EGFP-INS,并感染人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs),观察其表达及诱导hUCMSCs成脂分化的作用.方法 用EcoRI/XhoI将胰岛素基因从原始质粒上切下,定向插入至pShuttle-CMV-EGFP穿梭质粒,将验证正确的pShuttle-CMV-EGFP-INS中的EGFP-INS片段转移至pAdxsi载体上,构建pAdxsi-EGFP-INS重组腺病毒载体,用PacI限制性内切酶线性化后转染人胚肾细胞系HEK293细胞,扩增纯化重组腺病毒,测定病毒滴度.原代培养hUCMSCs,分别用pAdxsi-EGFP-INS(感染组)及pAdxsi-EGFP(对照组)腺病毒感染hUCMSCs,观察荧光蛋白的表达情况,成脂诱导剂诱导分化,油红O染色观察胰岛素对hUCMSCs成脂的诱导作用.结果 成功构建pAdxsi-EGFP-INS重组腺病毒载体,包装、纯化后获得滴度达4×1011 pfu/ml的重组腺病毒.分离获得hUCMSCs并传代、纯化,pAdxsi-EGFP-INS感染hUCMSCs后,EGFP-INS在胞浆及胞核表达;成脂诱导培养18 d后,感染组细胞呈现出含有大量小脂滴的脂肪样细胞,而对照组细胞含有少量较大的脂滴,感染组含脂滴的脂肪样细胞数量多于对照组.结论 获得的pAdxsi-EGFP-INS重组腺病毒可高效感染hUCMSCs,为进一步研究胰岛素在干细胞成脂诱导分化中的作用,追踪其在体内、体外表达情况提供了新工具.
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组织因子途径抑制物2基因真核表达载体的构建及鉴定
目的:构建人组织因子途径抑制物2(tissue factor pathway inhibitor 2,TFPI-2)基因的真核表达载体pEGFP-C1-TFPI-2,并对其进行酶切鉴定.方法:实验于2006-09/12在安徽省立医院中心实验室完成.实验方法:①从人胎盘组织中提取总RNA,反转录合成cDNA,以特异性引物扩增TFPI-2基因全长mRNA.②扩增产物回收纯化后用限制性内切酶酶切,与经同样处理的载体pEGFP-C1进行连接反应,连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α.③碱变性法提取质粒进行限制性内切酶酶切分析,并进行DNA序列测定.结果:①成功克隆了708 bp的TFPI-2基因片段.②构建了人TFPI-2基因的真核表达载体pEGFP-C1-TFPI-2,经限制性内切酶酶切,电泳分析后得到了大小分别为708 bp的目的基因片段和4.6 kb的载体片段,测序结果与TFPl-2 mRNA的cDNA序列吻合.结论:通过基因重组技术,构建了稳定表达TFPI-2的人TFPI-2的真核表达载体pEGFP-C1-TFPI-2.
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绿荧光蛋白基因质粒表达载体对SACC-83的转染效率及瞬时表达特点
目的:检测绿荧光蛋白基因(EGFP)质粒表达载体pACCMV-EGFP和pACTERT-EGFP对SACC-83的转染效率及瞬时表达,为应用这两种启动子诱导促凋亡基因转染SACC-83以发挥治疗作用提供依据.方法:实验于2004-07/2005-05在吉林大学口腔医学院口腔生物实验室完成.①在体外扩增并酶切鉴定pACCMV-EGFP和pACTERT-EGFP质粒.②以脂质体介导法转染pACCMV-EGFP和pACTERT-EGFP进入SACC-83细胞,根据质粒和脂质体比例不同分别转染6组,1组:1 g/4 L;2组:1 g/8 L;3组:1g/12 L;4组:2 g/4 L;5组:2 g/8 L;6组:2 g/12 L.③应用荧光显微镜观察各组转染效率及瞬时表达情况,并进行统计学分析.结果:①质粒的检测及鉴定:质粒pACTERT-EGFP和pACCMV-EGFP经转化、酶切电泳证实,均出现约800 bp的片段,与原作者提供的数据一致.②荧光显微镜观察:绿荧光蛋白在基因转染24 h后开始表达,48～72 h高,1周后表达逐渐减弱.③荧光细胞数的统计学分析:对不同浓度质粒与脂质体转染72 h的荧光细胞数进行方差分析,质粒与脂质体比例为1 g/8 L和2 g/8 L组荧光细胞数显著高于其余各组,其差异具有统计学意义,说明转染效率与脂质体和质粒的比例有关.结论:按照合适的质粒和脂质体比例,pACCMV-EGFP和pACTERT-EGFP转染SACC-83的效率可以达到30%,是转染SACC-83较为理想的瞬时表达载体.
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含双顺反子绿色荧光蛋白人骨形态发生蛋白2表达载体的构建
目的:骨形态发生蛋白2是目前研究为广泛、诱导成骨活性强的骨形态发生蛋白之一.实验拟构建绿色荧光蛋白标记的人骨形态发生蛋白2(human Bone Morphogenetic Protein-2,hBMP2)真核表达载体,为在真核细胞的高效表达和基因治疗打下基础.方法:实验于2006-03/2007-03在天津医科大学卫生部激素与发育重点实验室完成.①实验材料:含完整人骨形态发生蛋白2基因片段的pcDNA3.1/CT-hBMP2质粒由李曦铭博士惠赠;双顺反子真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS(Invivogen公司),Zeo(Invivogen公司):pTA2R-T Easy(鼎国生物技术有限公司).②实验过程及评估:以重组质粒pcDNA3.1/CT-hBMP2为模板,结合已设计好的特异性引物,采用聚合酶链反应方法亚克隆出人骨形态发生蛋白2目的片段,将该片段分别与克隆载体pTA2-T-easy和双顺反子真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS连接,转化入感受态DH5α细胞中,通过筛选得到含有绿色荧光蛋白的蘑组表达载体pSELECT-GFPzeo-hBMP2,并进行测序鉴定.结果:①聚合酶链反应获得长度约1 216 bp的目的片段,与预期片段相符.②经与克隆载体pTA2-T-easy和真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS连接,筛选及序列分析后,证实所插入目的片段与GenBank检索的骨形态发生蛋白2cDNA序列(NM-001200)100%匹配.结论:成功构建含双顺反子绿色荧光蛋白人骨形态发生蛋白2真核表达载体.
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血管生成抑制因子METH-1腺病毒载体的构建
目的:利用大肠杆菌同源重组构建重组腺病毒载体并在293细胞制备高滴度的病毒.方法:实验于2004-08/2005-08在中山大学眼科中心国家重点实验室完成.自真核表达载体pMD18-T-METH1中酶切出METH1基因,亚克隆至带有增强型绿色荧光蛋白表达盒的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,形成转移质粒pAdTrack-CMV-METH1,在大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组,得到重组腺病毒载体pAd-METH1.以pAd-METH1为模板,经DNA测序正确后,用PacI酶切线性化pAd-METH1,转染293细胞,包装成重组病毒颗粒,荧光显微镜观察转染细胞增强型绿色荧光蛋白的表达,采用聚合酶链反应方法对重组腺病毒进行鉴定.结果:①构建了携带外源基因人血管生成抑制因子的穿梭载体pAdTrack-CMV-METH1.②制备了METH1重组腺病毒载体pAdEasyMETH1.③METH1重组腺病毒可感染293细胞并在293细胞中进行有效的复制.结论:应用细菌内同源重组能够快速构建腺病毒载体,制备高滴度重组病毒,为METH1基因功能研究奠定了基础.
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同种异体骨髓间质干细胞移植在大鼠肝内的定居能力
背景:骨髓间充质干细胞具有极强的自我复制能力和多向分化潜能,但当体外分离培养的骨髓基质干细胞移植到体内后,其分布和定居情况不明,这关系到骨髓基质干细胞是否可以作为靶细胞治疗应用于临床.目的:探索绿色荧光蛋白标记的大鼠骨髓间质干细胞(MSCs),经不同途径移植到同种异体大鼠,其定居于肝脏的能力.设计:析因设计.单位:广东省第二人民医院普外科/中山大学博士后科研基地,南方医科大学珠江医院普通外科,中山大学附属第三医院器官移植科.材料:实验于2003-01/2004-12在解放军第一军医大学基础部药理教研室完成.选取清洁级成年SD大鼠36只,随机分为5组:CCL4+门静脉移植组(6只)、门静脉移植对照组(6只)、CCL4+尾静脉移植组(6只)、尾静脉移植对照组(6只)、混合组(12只).方法:①从大鼠骨髓中分离培养获取骨髓间充质干细胞,以绿色荧光蛋白进行标记,体外扩增后,以细针移植骨髓间充质干细胞悬液,移植量为0.5 mL/100 g.②CCL4+门静脉移植组:骨髓间充质干细胞移植前3 d,每天按20g/L的CCL4 2.5 mL/kg体质量灌胃饲养,首次计量加倍,标记的骨髓间充质干细胞从门静脉移植.门静脉移植对照组:骨髓间充质干细胞移植前正常饲养,标记的骨髓间充质干细胞从门静脉移植.CCL4+尾静脉移植组:骨髓间充质干细胞移植前3 d,每天按20 g/L的CCL4 2.5 mL/kg体质量灌胃饲养,首次计量加倍,标记的骨髓间充质干细胞从尾静脉移植.尾静脉移植对照组:移植前正常饲养,标记的骨髓间充质干细胞从尾静脉移植.混合组:前4组条件下,各设2只大鼠移植未标记的骨髓间充质干细胞;另设CCL4喂养3 d和正常喂养大鼠各2只,不行骨髓间充质干细胞移植.③于移植后的第3,7天,通过荧光定量PCR检测各组移植的骨髓间充质干细胞在大鼠肝脏的表达.主要观察指标:①骨髓间充质干细胞的分离纯化、体外扩增及表型鉴定结果.②绿色荧光蛋白标记骨髓间充质干细胞结果.③移植同源异体骨髓间充质干细胞后大鼠的生长情况观察.④各组肝脏组织中绿色荧光蛋白阳性DNA数的定量检测结果.结果:实验选取SD大鼠36只全部进入结果分析.①Percoll梯度分离液分离大鼠骨髓,所获得的细胞传代、扩增后,形态呈基本一致的梭性.细胞表面不表达CD34与CD45,而表达CD29,CD44,CD90等骨髓间充质干细胞的表面标志,是骨髓中区别于造血干细胞的另一群处于未分化状态的非定向干细胞.②骨髓间充质干细胞转染24 h后即可见发绿色荧光的细胞.48～72 h阳性细胞明显增多,强度增强,高倍视野下转染率达20%～30%,多为明亮的绿色荧光的细胞.作为对照的骨髓间充质干细胞中未发现发绿色荧光的细胞.③所有大鼠从不同途径移植标记或未标记的同源异体骨髓间充质干细胞后,第1天精神、食欲差,少活动;移植后第2天基本恢复正常饮食和精神,各组大鼠之间无明显差异.④除混合组外,其余各组于移植术后第3,7天,肝脏内均可检测到含绿色荧光蛋白阳性细胞.且CCL4+门静脉移植组、CCL4+尾静脉移植组肝脏组织中的绿色荧光蛋白阳性DNA数显著高于门静脉移植对照组、尾静脉移植对照组升高(P＜0.05).结论:干细胞定居于肝脏的时间与细胞数量可能与肝脏是否受损有关,与移植途径关系不密切.正常动物肝脏未受损情况下,干细胞可定居于肝脏,定植的细胞量与移植途径、移植后时间相关.
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构建重组大鼠pEGFP-N1-IGF-1基因表达质粒
目的:构建胰岛素样生长因子1基因的真核表达质粒(pEGFP-N1-IGF-1),为基因治疗脊髓损伤提供前提.方法:实验于2005-04/06在上海基康生物公司实验室完成.应用反转录-聚合酶链反应方法从大鼠肝脏组织总RNA中提取并扩增胰岛素样生长因子1基因的全长cDNA,并将该基因连接克隆到含有增强型绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N1上,以构建重组质粒pEGFP-N1-IGF-1.结果:实验从大鼠肝脏组织中提取总RNA,以反转录-聚合酶链反应方法获取编码胰岛素样生长因子1基因的全序列cDNA.构建胰岛素样生长因子1 cDNA真核表达质粒时将能发出绿色荧光的增强型绿色荧光蛋白报告基因融合在胰岛素样生长因子1基因,并经酶切后DNA电泳鉴定及DNA测序证实.结论:构建重组质粒pEGFP-N1-IGF-1成功,实验中将能发出绿色荧光的增强型绿色荧光蛋白报告基因融合在胰岛素样生长因子1基因的3'端,并以编码柔软肽段的核苷酸连接,即保留了胰岛素样生长因子1的神经营养活性,又便于基因治疗中可检测到蛋白表达.
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乙型肝炎病毒x蛋白基因荧光真核表达质粒的构建及其对人正常肝细胞株LO2增殖的影响
目的 构建乙型肝炎病毒x蛋白基因荧光真核表达质粒,并检测HBx对人正常肝细胞株LO2细胞增殖的影响.方法 以pcDNA3-HBV质粒为模板,PCR法扩增HBx基因编码区全长序列,将其克隆至pIRES2-EGFP荧光真核表达载体中,构建重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-HBx,转染LO2细胞,筛选稳定表达HBx的细胞,RT-PCR法检测细胞中HBx基因mRNA的转录水平；Western blot法检测细胞中HBx蛋白的表达水平；MTT法检测细胞的增殖活力.结果 重组荧光真核表达质粒pIRES2-EGFP-HBx经双酶切和测序证明构建正确,转染该质粒的LO2细胞可检测到HBx基因mRNA的转录及蛋白的表达,与空质粒pIRES2-EGFP转染的LO2细胞相比,增殖活力明显提高.结论 成功构建了HBx基因荧光真核表达质粒,并获得了能稳定表达HBx蛋白的LO2细胞株,为进一步研究HBx对细胞周期调控通路的影响及探索HBx导致的与HBV相关的HCC的分子机制奠定了基础.
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转染不同基因的NIT细胞体外抗细胞毒T细胞杀伤作用
目的 研究转染FADD缺失突变体(FADDdel)和WeelHu/GFP的胰岛β细胞株(NIT细胞)抵抗细胞毒T细胞的杀伤作用及其分泌胰岛素与细胞增殖所受的影响.方法 采用免疫磁珠法测量转染WeelHu基因的NIT细胞培养上清中的胰岛素水平及观察其增殖速度.将分别转染空载体pUC-pIC、pCMV和转染pFADDdel、pCMV-WeelHu、pCMV-WeelHu/GFP的NIT细胞与活化的淋巴细胞共培养,利用51Cr释放试验检测淋巴细胞对NIT细胞的杀伤作用.结果 转染WeelHu基因与未转染的NIT细胞胰岛素的分泌和生长速度没有明显变化(P＞0.05).转染pCMV-WeelHu/GFP或pCMV-WeelHu的NIT细胞其抗淋巴细胞杀伤能力明显高于转染空载体的NIT细胞(P＜0.01),表达WeelHu或WeelHu/GFP融合蛋白的胰岛细胞之间抗凋亡能力差异无统计学意义,转染FADDdel在低剂量效靶比时对胰岛β细胞有一定保护作用(P＜0.05),但在高剂量效靶比时与转染空载体比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 表达WeelHu或FADDdel的胰岛细胞可抵抗T细胞的杀伤,且对胰岛素的分泌及细胞增殖无明显影响.
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绿色荧光蛋白转基因大鼠骨髓间充质干细胞在急性脊髓损伤大鼠中的迁移和分化
目的 观察绿色荧光蛋白转基因大鼠来源的骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)在急性脊髓损伤大鼠脊髓组织中的迁移和分化情况.方法 全骨髓贴壁培养法培养BMSCs,Allen法制作脊髓损伤大鼠模型,共30只大鼠.于造模1周后进行干预,随机选取造模成功的24只大鼠并随机分为脊髓损伤组、假移植组(生理盐水注射)和细胞移植组(BMSCs注射),每组8只.于移植前、移植后7d、14 d、21 d、28 d、35 d及42 d进行BBB(Basso,Beattie&Bresnahan locomotor rating scale)评分.HE染色、免疫荧光观察脊髓损伤的组织修复和BMSCs的迁移分化情况.结果 从第14天始,细胞移植组大鼠的BBB评分较脊髓损伤组和假移植组大鼠高,差异具有统计学意义(P＜0.05).HE染色显示细胞移植组大鼠的脊髓结构相对完整,液化和囊泡区缩小,炎性细胞减少.免疫荧光显示BMSCs聚集于脊髓损伤处,且能分化为神经元、神经胶质细胞和神经前体细胞.结论 BMSCs能向脊髓损伤部位迁移和聚集,并分化为相应的神经细胞促进脊髓功能恢复.
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脂质体介导胶质细胞生长因子真核表达载体在大鼠脊髓内的表达
目的 研究脂质体介导增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)和胶质细胞生长因子2(glial growth factor 2,GGF2)的双基因真核表达载体在脊髓内转染及其表达变化.方法 构建GGF2与EGFP双基因真核表达载体pIRES2-EGFP-GGF2.采用注射法将阳离子脂质体和pIRES2-EGFP-GGF2质粒混合后转染至大鼠胸段脊髓组织中.采用RT-PCR法检测不同时间点转染区域脊髓组织中GGF2 mRNA的表达.在荧光显微镜下观察不同时间点EGFP在大鼠脊髓中的表达.结果 基因转染后2d即可观察到EGFP的表达及GGF2 mRNA表达的增加,在基因转染后1～2周内EGFP及GGF2 mRNA呈高水平表达,基因转染4周后,EGFP及GGF2 mRNA的表达明显减少.结论 脂质体介导pIRES2-EGFP-GGF2转染大鼠脊髓后其表达的特点有助于基因治疗效果的即刻性,即早期大量表达,起到基因治疗的作用,又可避免外源基因的持续表达.
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慢病毒载体介导绿色荧光蛋白基因在椎间盘髓核细胞中的表达
目的 本研究构建含绿色荧光蛋白基因的重组慢病毒,并观察其在人椎间盘髓核细胞中的表达情况.方法 应用分子克隆技术将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)基因导入慢病毒载体质粒pLenti6/V5 TOPO,应用磷酸钙沉淀法将慢病毒载体三质粒系统(包括包装质粒、包膜蛋白质粒等)共转染入293细胞进行包装,48 h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,72 h收集病毒上清并感染髓核细胞,在荧光显微镜下感染情况.结果 重组慢病毒滴度测定约为107 U /mL.感染人椎间盘髓核细胞后,荧光显微镜下观察到GFP的表达.结论 成功构建了含GFP的慢病毒载体,且能成功将目的 基因转入椎间盘髓核细胞并表达.
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睾丸特异性新基因T490真核荧光表达载体的构建及其表达
目的 构建含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的睾丸特异性新基因T490超表达质粒pDT490-EGFP,检测其在Hela细胞中的表达情况.方法 采用RT-PCR的方法从成年Balb/c小鼠睾丸组织中扩增T490基冈,将该基凶连接克降到含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的真核表达载体pEGFP-N1上,再将T490和EGFP融合基因酶切下来,克隆到pcDNA3.1(-)真核超表达载体上,以构建重组质粒pDT490EGFP.将该重组质粒通过阳性脂质体Lipofectamine 2000导入Hela细胞系中,在荧光显微镜F观察转染24h后融合基因的超表达情况,并用RT-PCR的方法进一步证实目的 基因mRNA的表达水平.结果 RT-PCR获取编码T490基因的全序列cDNA,大小为508bp;DNA测序和PCR方法证实T490和EGFP融合基因成功克隆到真核超表达载体L;在荧光显微镜下,转染24h后的Hela细胞具有很强的绿色荧光;RT.PCR显示转染后的Hela细胞T490基因mRNA的表达明显.结论 重组质粒pDT490-EGFP构建成功,并在细胞内明显表达,此质粒可应用于研究睾丸特异性新基因T490的功能,为T490的生物学研究奠定基础.
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人肝癌细胞中缺氧反应元件对微环境的反应
目的:通过观察缺氧反应元件(hypoxia-response element,HRE)调控下,绿色荧光蛋白质(green fluorescent protein,GFP)构建的肝癌细胞Bel-7402/5HRE-EGFP在缺氧条件下,缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等表达水平的变化,研究HRE对微环境的反应特性.方法:以5个串连的HRE和巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)的微小启动子为转录调控元件、GFP为报告基因构建表达载体,应用FCM和细胞免疫染色法观察缺氧、一氧化氮、过氧化物和酸性pH等微环境的变化对人肝癌细胞Bel-7402中HRE活性的影响,以及缺氧条件下HIF-1α、VEGF表达水平的变化.观察缺氧探针哌莫硝唑的染色强度和分布与HIF-1α、VEGF和GFP表达强度和分布之间的关系,探求裸鼠体内肿瘤组织缺氧对HRE活性及其相关基因表达的影响.结果:肝癌细胞中HRE对缺氧非常敏感,肿瘤细胞和组织缺氧时可上调HIF-1α和VEGF的表达,两者的分布也基本一致.结论:缺氧在调控肝癌血管生成因子表达方面可能起着重要的作用.
