首页 > 文献资料
-
醋制降低京大戟对人正常肝细胞LO2的毒性及机制研究
目的:比较京大戟醋制前后对人正常肝细胞LO2的毒性作用,并探讨其可能的作用机制.方法:体外培养LO2细胞,用不同浓度的京大戟生品和醋品对其进行处理,MTT法测定各样品对LO2细胞增殖的抑制作用；Hoeehst 33258荧光染色法观察细胞凋亡的形态学改变；AnnexinV/PI染色流式细胞术检测LO2细胞凋亡；PI染色流式细胞术分析其对细胞周期的影响；检测细胞培养液上清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)活力,细胞裂解上清超氧化歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)含量.结果:与阴性对照组比较,京大戟生品各浓度组均可抑制LO2细胞增殖,诱导细胞凋亡,引起细胞S期阻滞(P＜0.05)；能显著升高细胞培养液上清ALT,AST,LDH活力(P＜0.05),显著降低细胞裂解上清SOD活性和GSH含量、增加MDA含量.醋制后,与京大戟生品组比较,可显著降低细胞凋亡率、降低细胞周期阻滞,显著降低细胞培养液上清ALT,AST,LDH活力(P＜0.05),显著升高细胞裂解上清SOD活性和GSH含量、显著降低MDA含量.结论:醋制可降低京大戟对LO2细胞的毒性,其机制可能是减轻氧化损伤,从而降低细胞周期阻滞,减少细胞凋亡.
-
不同方法炮制甘遂对LO2细胞周期与凋亡的影响
目的:探讨不同方法炮制所得甘遂各样品对人正常肝细胞LO2细胞周期与凋亡的影响.方法:以人正常肝细胞LO2为研究对象,采用MTT法检测甘遂醋制前后各炮制品(生品、清炒品、酷润品、醋制品)对LO2细胞活性的影响,采用倒置显微镜观察细胞形态,采用流式细胞术研究甘遂醋制前后各炮制品对LO2细胞周期和凋亡的影响.结果:与阴性对照组比较,甘遂生品可明显降低LO2细胞的活性(P＜0.01)和形态,显著升高S期细胞百分率(P＜0.05),显著降低G2/M期细胞百分率(P＜0.01),显著增加人正常肝细胞LO2细胞的早期凋亡率、晚期凋亡坏死率、总凋亡率(P＜0.01)；与甘遂生品组比较,甘遂各炮制品均能降低对人正常肝细胞L02的增殖抑制作用(P＜0.01)和形态变差的趋势,其降低增殖抑制作用的顺序为醋制品＞醋润品＞清炒品,且呈一定的量-效关系(r醋制=0.999,r醋润=0.913,r清炒=0.914,r生品=0.984)；且均能显著增加G2/M期细胞百分率(P＜0.05,P＜0.05,P＜0.01),显著减少人正常肝细胞LO2的早期凋亡率、晚期凋亡坏死率、总凋亡率(P＜0.01),其增加G2/M期细胞百分率的顺序和降低凋亡率的顺序均为醋制品＞醋润品＞清炒品.结论:甘遂炮制后可通过影响LO2细胞周期与凋亡降低其毒性,且甘遂醋制工艺中的炒与醋润2种操作在醋制降低甘遂的肝毒性中能够起到协同作用,从而为揭示上述2种操作在甘遂醋制减毒工艺中的合理性和醋制工艺优化提供了一定的依据.
-
S1P对人LO2肝细胞株胰岛素抵抗模型糖代谢的影响
目的 观察鞘氨醇激酶1(SPK1)催化产物1-磷酸鞘氨醇(S1P)对LO2肝细胞胰岛素抵抗模型糖代谢的影响.方法 用胰岛素诱导人正常肝细胞(LO2)产生胰岛素抵抗,MTT法检测LO2细胞增殖,葡萄糖-己糖激酶法检测培养基残存葡萄糖浓度,油红O鉴定LO2细胞脂肪变性,荧光双染法鉴定线粒体ROS,Western blot检测SPK1蛋白表达.结果 与对照组相比,10、100和1 000 nmol/L 3个浓度的胰岛素对细胞葡萄糖摄取能力无显著影响;1 000 nmol/L浓度的胰岛素作用细胞48 h时胰岛素敏感指数下降,胰岛素抵抗模型建立.与对照组相比,模型组细胞脂滴面积增加(P＜0.05),SPK1表达量呈增加趋势,线粒体ROS也显著增加.在模型组中加入S1P后,可显著促进细胞对葡萄糖的吸收(P＜0.05).结论 成功构建胰岛素诱导的LO2肝细胞胰岛素抵抗模型,并且发现S1P可以促进模型细胞糖代谢,提示S1P可作为筛选降糖药物的新靶点.
-
骨化三醇对脂肪变性肝细胞三酰甘油代谢及细胞因子信号转导抑制因子-3基因表达的影响
目的 研究骨化三醇对脂肪变肝细胞三酰甘油代谢及细胞因子信号转导抑制因子-3(SOCS-3)基因表达的影响.方法 以油酸(OA)诱导正常人肝细胞LO2脂肪变为模型,按加入骨化三醇浓度的不同(10-8、10-7、10-6 mol/L)分为三个干预组,设空白对照组.干预组先加入不同浓度骨化三醇干预24h,之后加0.2 mmol/L的OA24h.检测细胞内三酰甘油(TG)、上清液谷草转氨酶(AST)含量,采用实时荧光定量PCR检测各组细胞SOCS-3 mRNA的表达,多组间比较采用单因素方差分析进行数据分析.结果 模型组TG[(362.43±22.20)mg/dL]、AST[(5.550.46)U/L]、SOCS-3 mRNA表达(4.61±0.39)均较对照组[(175.78±7.69)mg/dL、(0.63±0.33)U/L、(1.00±0.00)]明显增高(P＜0.01);干预组TG分别为(286.87±16.01)、(257.16±11.73)、(209.43±27.79)mg/dL,AST分别为(4.98±0.50)、(4.23±0.36)、(3.50±0.48)U/L,SOCS-3 mRNA表达分别为(3.71±0.69)、(2.67±0.70)、(1.31±0.42),较模型组均有所下降,差异均有统计学意义(均P＜ 0.05).结论 骨化三醇可抑制肝细胞脂肪变,其作用机制可能与骨化三醇抑制SOCS-3的表达有关.
关键词： 骨化三醇 LO2细胞 三酰甘油 细胞因子信号转导抑制因子-3 -
二氯乙腈对LO2细胞周期的影响及其相关调控机制的研究
目的 探讨二氯乙腈(dichloroacetonitrile,DCAN)对细胞周期的影响及其相关的调控机制.方法 用二甲基亚砜(DMSO)溶解DCAN,以DMSO处理人胚肝细胞(LO2细胞)为对照组,采用Cell Counting Kit-8试剂盒检测0～5 000 μmol/LDCAN对细胞存活率的影响,分别用10、50、100、500.μmol/L DCAN处理LO2细胞为染毒组,以碘化丙啶(PI)标记的流式细胞技术检测细胞周期分布情况,以实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测chkl基因、chk2基因、p53基因和bcl-2基因mRNA表达的改变.结果 CCK-8结果显示:随DCAN浓度增加LO2细胞存活率降低,DCAN引起LO2细胞的IC50为583.25 μmol/L;与对照组比较,500μmoI/LDCAN处理组G1期细胞比例明显减少,G2期细胞比例明显增加,差异均有统计学意义(P＜0.05);500 μmoI/L DCAN作用于LO2细胞后上调了p53的表达,下调了bcl-2和chk2的表达,差异有统计学意义(P＜0.05),而对chkl的表达没有影响.结论 DCAN可能通过上调p53和下调bcl-2的表达使细胞阻滞于G2期.
-
栀子、连翘等中药配方颗粒体外肝细胞毒性研究
目的:对栀子、连翘、大黄、续断、首乌藤、麻黄、淫羊藿、丹参、地黄、陈皮10种中药配方颗粒的体外肝细胞毒性进行研究评价.方法:以人正常肝细胞LO2为研究对象,设定一系列浓度梯度,MTT法观察不同浓度配方颗粒对LO2细胞的细胞毒作用;Hoechst 33258荧光染色法观察细胞核形态.结果:100、1 000 mg/L栀子配方颗粒对LO2细胞呈现明显毒性作用(P＜0.05或P＜0.01),荧光染色可见明显的核荧光强度增强、固缩等凋亡表现;连翘等其他9种配方颗粒在0.001 ～1 000 mg/L范围内,对LO2细胞无明显毒性作用(P＞0.05),也未观察到明显的细胞核形态学改变.结论:本研究以中药配方颗粒作为体外实验的载体,对栀子、连翘等10种常用中药配方颗粒的早期肝毒性进行了评价,提示栀子配方颗粒若在较大剂量下使用,可能会存在明显的肝脏毒性,其他9种中药配方颗粒对人正常肝细胞LO2无明显毒性,为上述中药配方颗粒的临床应用提供了参考.
-
乙型肝炎病毒x蛋白基因荧光真核表达质粒的构建及其对人正常肝细胞株LO2增殖的影响
目的 构建乙型肝炎病毒x蛋白基因荧光真核表达质粒,并检测HBx对人正常肝细胞株LO2细胞增殖的影响.方法 以pcDNA3-HBV质粒为模板,PCR法扩增HBx基因编码区全长序列,将其克隆至pIRES2-EGFP荧光真核表达载体中,构建重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-HBx,转染LO2细胞,筛选稳定表达HBx的细胞,RT-PCR法检测细胞中HBx基因mRNA的转录水平；Western blot法检测细胞中HBx蛋白的表达水平；MTT法检测细胞的增殖活力.结果 重组荧光真核表达质粒pIRES2-EGFP-HBx经双酶切和测序证明构建正确,转染该质粒的LO2细胞可检测到HBx基因mRNA的转录及蛋白的表达,与空质粒pIRES2-EGFP转染的LO2细胞相比,增殖活力明显提高.结论 成功构建了HBx基因荧光真核表达质粒,并获得了能稳定表达HBx蛋白的LO2细胞株,为进一步研究HBx对细胞周期调控通路的影响及探索HBx导致的与HBV相关的HCC的分子机制奠定了基础.
-
人FBP17基因重组真核表达质粒的构建及其在LO2细胞中的表达
目的 构建人FBP17基因重组真核表达质粒,并检测其在人正常肝细胞LO2中的表达及对细胞存活率的影响.方法 用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切pEGFP-C1-FBP17质粒,胶回收FBP17基因片段,与p3X FLAG-CMV- 10载体连接,构建重组真核表达质粒p3XFLAG-CMV-10/FBP17,LipofectamineTM法转染人正常肝细胞LO2,RT-PCR和Western blot法检测转染细胞中FBP17基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平,XTT法检测其对转染细胞增殖的影响.结果 重组表达质粒p3XFLAG-CMV-10/FBP17经双酶切及测序证实构建正确；转染该重组质粒的LO2细胞FBP17基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平均明显增高,且该质粒转染对细胞存活率无影响.结论 成功构建了FBP17基因重组真核表达质粒,其可在LO2细胞中表达,且对细胞的存活率无影响,为进一步研究FBP17相互作用蛋白及其功能奠定了基础.
-
大片形吸虫排泄分泌产物对体外培养LO2人肝细胞的影响
目的 初步探讨大片形吸虫排泄分泌产物(FgESP)对体外培养LO2人肝细胞的增殖及对肝细胞损伤相关的生化指标的影响.方法 将LO2人肝细胞分为5个密度组(1 000、3 000、5 000、7 000、10 000个/孔),铺于96孔板中,空白对照组只加入培养基,根据LO2细胞生长曲线选择适细胞铺板密度.在96孔板中,以适细胞密度铺板,分为0.02、0.10、0.20、0.40、1.00 mg/ml FgESP等5组,每组设4个重复,以PBS作为阴性对照组,在培养箱中孵育4、8、12、24、48和72 h后进行MTT细胞活性检测,测吸光度(A490值).在24孔板中,分为0.02、0.10、0.20、0.40、1.00 mg/ml FgESP等5组,每组设3个重复,以PBS作为阴性对照组,分别在培养4、8、12、24、48和72 h后,收集LO2细胞上清,测定碱性磷酸酶(ALP)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转氨酶(ALT)、白蛋白(ALB)的含量.采用GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析.结果 根据LO2人肝细胞生长曲线,筛选出5 000个/孔为96孔板佳铺板密度.FgESP作用72 h后,MTT细胞活性检测结果显示,0.02、0.10、0.20、0.40、1.00 mg/ml FgESP等5组的A 490值分别为1.29±0.01、1.28±0.06、1.13±0.08、0.97±0.06、0.25±0.01,均低于对照组(1.45±0.05) (P＜ 0.01).生化指标检测结果显示,0.40、1.00 mg/ml FgESP作用细胞LO2人肝72 h后,ALT含量分别为2.00±0.00、3.67±0.58,AST含量分别为5.33±0.58、7.67±0.58,均高于对照组的(P＜0.01);作用48 h后,1.00 mg/ml FgESP组ALT、AST含量分别为2.00±0.00、7.00±0.00,高于对照组的0.33±0.58、3.67±0.58 (P＜ 0.01);在12～72 h内,0.10、0.20、0.40、1.00 mg/mlFgESP作用后ALP含量升高(P＜0.01),而0.02 mg/ml FgESP仅在作用72 h后ALP含量升高(P＜0.01);各实验组ALB含量与阴性对照组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 FgESP体外作用可抑制LO2人肝细胞增殖能力,且细胞增殖的抑制及损伤程度与FgESP的浓度相关.
-
ACTN4对肝癌细胞侵袭转移的影响
目的 探索α-辅肌动蛋白4(alpha-actinin-4,ACTN4)在肝细胞癌HepG2细胞及人正常肝细胞系LO2中的表达及沉默ACTN4对肝癌细胞HepG2侵袭和转移能力的影响.方法 通过qRT-PCR技术及Western blot技术检测ACTN4在肝细胞癌细胞HepG2及人正常肝细胞系LO2中的表达情况;利用RNAi技术下调HepG2细胞中的ACTN4表达,并应用qRT-PCR及Western blot技术检测HepG2细胞中ACTN4的沉默效果;Transwell实验检测细胞侵袭及转移能力的变化.结果 ACTN4在肝细胞癌HepG2细胞中明显高表达;ACTN4-siRNA可有效沉默HepG2细胞中ACTN4的表达,沉默ACTN4的表达可以明显降低HepG2细胞的侵袭、转移能力.结论 ACTN4与肝细胞癌细胞的侵袭、转移密切相关.
-
三白草中化学成分对H2O2损伤LO2细胞保护作用
目的 研究三白草中主要化学成分对H2O2损伤人正常肝细胞LO2的保护作用.方法 供试品为三白草中木脂素类成分:Rel-(7S,8R,7'R,8'R)- 3,3',4,4’,5,5'-hexamethoxy-7-O-7’,8,8’-llignan、Di-O-methyltetra hydrofuriguaiacin B、里卡灵A、里卡灵B、三白草素、二氢愈创木酸;黄酮类成分:异槲皮苷、槲皮苷.LO2细胞接种于96孔板培养,加入100 μmol/L的受试成分,培养24 h后加入20 μL 1.2 mmol/L H2 O2作用1h.使用MTT法检测各组细胞存活率.结果 异槲皮苷和槲皮苷对H2O2损伤LO2细胞有显著保护作用,里卡灵A和二氢愈创木酸对细胞有显著损伤作用.结论 该实验可以为三白草保肝作用的研究提供理论基础.
-
RBP4分子RNAi载体的制备及对人肝细胞系LO2中ERK信号通路的影响
目的 制备人视黄醇结合蛋白4(RBP4)分子RNAi载体,检测其干涉人肝细胞系LO2中RBP4的表达后对ERK1/2表达及磷酸化和葡萄糖摄取的影响.方法 分别构建针对RBP4基因表达框5′端和3′端的干涉载体及真核表达载体,经测序和酶切鉴定后将载体转染LO2,RT-PCR和Western blot法确定其干涉RBP4表达的效率,选择干涉较高的载体用于后续实验;Western blot检测ERK1/2的表达及磷酸化水平的改变,葡萄糖氧化酶法检测上清液中葡萄糖的残留量.结果 构建的真核表达载体和干涉载体经酶切、测序鉴定结果正确,并有明显的高表达或干涉效果.Western blot结果表明ERK1/2的表达量无明显变化,RBP4高表达组其磷酸化显著下降,RBP4干涉组其磷酸化显著上升.胰岛素刺激后RBP4高表达组的葡萄糖摄取明显下降,RBP4干涉组的葡萄糖摄取明显增加.结论 成功制备RBP4基因的干涉载体并应用于LO2细胞中ERK1/2通路的研究,为后续RBP4的进一步功能研究奠定基础.
-
不同溶剂中油酸对LO2和HepG2细胞生长和活力的影响
目的 探讨以二甲基亚砜(DMSO)和牛血清白蛋白(BSA)分别溶解的油酸(OA)对人正常肝细胞(LO2)株和人肝癌细胞( HepG2)株的影响,寻找合适的脂肪酸溶剂以及体外研究脂代谢的肝细胞系.方法 LO2和HepG2细胞均分为:空白组,DMSO组,DMSO+不同浓度油酸组,BSA组,BSA+不同浓度油酸组.培养48 h后,采用MTT法检测细胞活力,油红O染色观察活细胞数目和胞内脂滴变化;甘油-3-磷酸氧化酶法检测细胞内甘油三酯(TG)的含量.结果 以DMSO溶解的(0.4～6.4) μg/ml油酸分别处理的LO2和HepG2细胞,细胞生长曲线均呈先上升后下降的趋势,除1.6μg/ml浓度组LO2细胞生长接近空白对照组外,其它组细胞活力均显著低于对照组(P＜0.05);同样以BSA溶解的(0.4～6.4) μg/ml油酸分别处理LO2和HepG2细胞,各组细胞活力均高于空白组,呈上升趋势(P＜0.01).油红O染色显示两细胞株在DMSO溶解OA处理后,与空白组比较,油酸组细胞内脂滴增多,但细胞数目减少;而在BSA溶解下,细胞内脂滴和活细胞数目均随OA浓度增加而增加,各组细胞内TG含量变化趋势与油红O染色结果类似,以LO2细胞株更为敏感.结论 作为OA溶剂,BSA较DMSO合适;LO2较HepG2细胞更适合作为体外研究脂代谢的细胞株.
-
LncRNA SRA在游离脂肪酸诱导的LO2细胞脂肪蓄积中的作用
目的 通过游离脂肪酸(FFA)刺激LO2细胞来观察肝细胞脂肪蓄积的情况和长非编码RNA类固醇受体RNA激活剂(LncRNA SRA)在其中的调控机制.方法 体外培养人肝癌细胞系LO2细胞,采用不同浓度的棕榈酸(PA)(0、0.2、0.4、0.8 mmol/L PA)处理细胞.采用油红O染色检测LO2细胞内脂肪蓄积情况;qPCR和Western blot分别测定细胞内基因和蛋白表达情况.结果 0.2 mmol/L的PA刺激能使LO2细胞发生脂肪蓄积.与对照组比较,PA组LO2细胞LncRNA SRA的表达异常升高(P<0.05),脂肪甘油三酯脂酶(ATGL)和叉头框蛋白O1(FoxO1)的表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.05).结论 游离脂肪酸可以导致LO2细胞脂肪蓄积性损伤,可能是通过LncRNA SRA抑制ATGL的表达,进而降低脂质氧化的途径完成的.
-
三黄茵赤方含药血清对LO2细胞DNA氧化损伤的影响
目的 探讨三黄茵赤方含药血清对H2O2诱导LO2细胞DNA氧化损伤的保护作用.方法 采集三黄茵赤方含药血清,以LO2细胞株为研究对象,通过H2O2诱导LO2细胞DNA氧化损伤模型,实验分正常对照组、H2O2模型组、三黄茵赤方含药血清5％、10％、15％浓度组、维生素E组,采用倒置显微镜观察各组形态,CCK-8法测定细胞存活率,生化法检测细胞内SOD、CAT和GSH-PX活性,流式细胞仪检测细胞内ROS水平,ELISA检测细胞内8-OHdG含量,彗星实验检测细胞DNA损伤情况.结果 与H2O2模型组比较,三黄茵赤方含药血清10％、15％浓度组、维生素E组均能提高细胞存活率(P＜0.05),增强细胞内SOD、CAT、GSH-PX活性(P＜0.05),改善细胞对ROS清除能力(P＜0.01),降低细胞内8-OHdG含量(P＜0.01),减低细胞拖尾率、尾长、尾矩及Olive尾矩(P＜0.05).结论 三黄茵赤方含药血清对H2O2诱导LO2细胞DNA氧化性损伤具有保护作用,以15％浓度含药血清组作用显著.
-
低氘水对肝癌HepG2细胞增殖和侵袭能力的抑制作用
目的 探讨低氘水(deuterium-depleted water,DDW)对肝癌HepG2细胞增殖、侵袭能力的抑制作用.方法 HepG2细胞及正常肝细胞L02用50、75、100、150 ppm DDW(纯净水对照组)处理,用MTT法、平皿克隆实验检测细胞增殖、侵袭转移能力,Western blot检测增殖细胞核抗原(PCNA)表达.结果 100 ppm DDW处理24 h对LO2细胞、72 h对HepG2增殖抑制无影响(P＞0.05).HepG2在50、75 ppm DDW中细胞克隆数均低于对照组,而LO2细胞克隆数高于对照组(P＜0.01).50、75、100 ppm DDW处理后HepG2细胞PCNA表达明显低于对照组(P＜0.01).结论 DDW可抑制HepG2细胞增殖和侵袭能力,但促进正常细胞LO2生长,这可能与PCNA表达下调有关.
-
Pdx1与Ngn3协同诱导LO2细胞分化为胰腺β样细胞
目的:胰腺十二指肠同源框蛋白1(Pdx1)与神经源素3(Ngn3)联合诱导肝实质细胞向胰腺β样细胞分化.方法:以人胚胎胰腺组织基因组的mRNA为模板经RT-PCR扩增获得Pdx1与Ngn3基因.应用分子生物学技术,分别克隆到真核表达载体pEGFP-C1的多克隆位点中,构建pEGFP-C1/Pdx1与pEGFP-C1/Ngn3真核表达质粒,并共转染LO2细胞,用RT-PCR、免疫组化、间接荧光法检测目的基因及胰岛素相关基因葡萄糖转运体2(GLUT2)与胰岛素的表达情况.结果:目的基因克隆正确,RT-PCR、免疫组化、间接荧光证实转染后LO2细胞中有Pdx1、Ngn3和胰岛素及胰岛素相关基因GLUT2的表达.结论:Pdx1与Ngn3协同作用可诱导肝实质细胞向胰腺β样细胞分化.
关键词： 胰腺十二指肠同源框蛋白1 神经源素3 LO2细胞 转分化 胰腺β样细胞 -
人PNPLA3基因启动子转录调控的初步分析
目的 构建人PNPLA3基因不同长度的上游启动子荧光素酶报告基因裁体,在LO2细胞中比较不同长度启动子片段的活性,为研究PNPLA3基因的转录调控机制提供初步依据.方法 对PNPLA3基因5’侧翼区约1400个碱基进行生物信息学分析,预测其转录调控区域；利用PCR及酶切方法,以人外周血中全基因组DNA为模版扩增不同长度的PNPLA3基因上游启动子区序列,分别构建荧光素酶基因报告载体.瞬时转染LO2细胞,利用双荧光素酶报告基因分析系统检测各启动子的转录活性.利用在线分析软件预测PNPLA3基因主要转录调控区的潜在转录因子结合位点.结果 成功构建5段不同长度的PNPLA3基因上游启动子区的报告载体；在LO2细胞内启动子活性随片段长度变化,表现为当PNPLA3启动子片段从-1015截短到-647,从-647截短至-553,从-553截短至-333时活性变化不大,而从-333截短至-8时活性显著下降(P＜0.05)；Match分析显示-333～-8片段具有多个转录因子结合位点.结论 初步判断-333 ～8区是PNPLA3基因的主要转录调控区.
