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  • 纳米孔技术检测蛋白质的研究新突破

    作者:张献

    目的 探讨纳米孔技术检测蛋白质的研究新突破.方法 应用氮化硅材料纳米孔芯片,初步研究金纳米棒及BSA易位行为,建立应用纳米孔检测纳米颗粒样品及蛋白质生物分子样品方法,统计分析纳米颗粒的易位信号及蛋白质分子信号;按照实验所获得的易位信号,总结常见的易位信号类型;按照实验结果模拟固态纳米孔内电场及纳米孔周围电场,获得不同电压下同一纳米孔的电场强度比较.结果 实验选择孔径为78 nm的固态纳米孔检测蛋白质BSA,将溶于1M KCl溶液内的样品,加入至流体内,偏置电压变换获得BSA分子过孔信号图;选择76 nm的纳米孔在980 mV、900 mV、400 mV电压下检测12 nm的蛋白质BSA分析易位结果,易位事件的原始信号如图2;400 mV电压下纳米孔与蛋白质的相互作用较强,易位事件相对较为分散,而980 mV及900 mV电压下,纳米孔与蛋白质分子的作用时间较短,分子过孔速度较快,出现的易位事件也较多;激发波长为280 nm时,BSA在自然折叠态时内源荧光发射峰的大发射波长位于346 nm附近,说明色氨酸残基部分被隐藏;随着尿素浓度的升高,BSA的相对荧光强度逐渐下降,出现荧光猝灭现象,说明BSA及尿素发生作用,导致BSA变性,但在0~5 M时,蛋白质出现部分变性,6M后,峰值出现显著红移,BSA完全变性;蛋白质BSA和经尿素变性后的BSA易位原始信号图.BSA加入后,电流基线较波动,后出现易位信号,蛋白质易位时间的长短,与BSA与孔的作用及蛋白质结构密切相关;加入经尿素变性的BSA后,电流基线总体稳定但变细,易位信号峰顶端较尖.结论 氮化硅纳米孔检测蛋白质应用为后续的纳米孔传感器在蛋白质研究中提供理论及实验基础.

  • 冬凌草乙素与牛血清白蛋白相互作用及其机制研究

    作者:吴干斌;褚延乐

    建立冬凌草乙素药物浓度的液相色谱-串联质谱分析方法,研究其与牛血清白蛋白(BSA)的结合情况以分析冬凌草乙素的血清蛋白结合机制.采用超滤法结合LC-MS/MS测定冬凌草乙素与牛血清白蛋白的蛋白结合率及相关结合常数,以Scatchard方程计算冬凌草乙素与BSA的结合常数(Ka)和结合位点数(n),并对冬凌草乙素与BSA的结合机制进行分析探究.结果显示冬凌草乙素与牛血清白蛋白的平均结合率为57.2%,且结合类型主要为一类强结合,相关参数为结合常数2.54×104 L·μg-1,结合位点的数目为n=0.75.冬凌草乙素与牛血清白蛋白的结合在考察浓度范围内无浓度依赖.该研究建立的方法灵敏度高、专属性强、操作简单,能够满足分析要求,结合常数的求算为临床药物相互作用以及药动学研究奠定了基础.

  • 大鼠胰岛分离技术的建立及胰岛活性的影响因素

    作者:常宝成;张宏;郑凝;赵伟;张秋梅;卫立君;方佩华

    目的 建立稳定有效的大鼠胰岛分离方法,探讨影响胰岛活性的因素.方法 通过胆管注射胶原酶方法提取大鼠胰岛,通过水浴法比较不同条件下葡萄糖刺激的胰岛素分泌,用放免法(RIA)测定胰岛素.结果 牛血清白蛋白(BSA)能明显提高葡萄糖刺激的胰岛素分泌水平,长时间培养(>7 d)的胰岛,其葡萄糖刺激的胰岛素分泌下降约25%,而新鲜分离的胰岛和经1~5 d培养的胰岛未见明显差异.RPMI1640培养液中葡萄糖浓度11.1 mmol/L组,其胰岛素分泌明显高于5.5 mmol/L和25 mmol/L这2组.结论 BSA、RPMI1640培养液中葡萄糖浓度及培养时间均与分离胰岛活性有关.

  • 运用两种BSA剂量建立IgA肾病大鼠模型观察

    作者:张静;李静;桑晓红;刘健;王丽娜;苗娜

    目的:目前IgA肾病(IgAN)动物模型并无经典造模方法,本实验选择国内较常用方法建立大鼠IgAN模型,分两个时间点观察不同剂量牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)灌胃联合注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)+四氯化碳(carbon terachloride,CCL4)方法建立IgA肾病模型效果.方法:将SPF级健康雄性SD大鼠60只(平均体重200~240 g)随机分为3组,每组20只.低剂量组(A组):BSA400 mg/kg(100 g/L)隔天灌胃,持续12周;皮下注射蓖麻油0.3 ml+CCL4 0.10 ml,每周1次持续12周,第8周LPS 0.05 mg尾静脉注射.高剂量组(B组):BSA增加至600 mg/kg(100 g/L),余干预同低剂量组.对照组(C组)生理盐水4 ml/kg灌胃,0.4 ml皮下注射.建模后第8周、12周每组各处死10只大鼠,留取血、尿、肾组织标本检测.观察指标:一般情况、蛋白尿、血尿、肝肾功能、肾组织病理.结果:模型组大鼠血肌酐、尿素氮及尿蛋白均明显增高(P<0.05),高剂量组显著高于低剂量组(P<0.05),且肾组织病理8周后均出现轻中度系膜细胞及系膜基质的增生,12周末显著伴肾间质轻度纤维化,高剂量组病变较重;12周末均有荧光出现,均强于第8周,低剂量组荧光表达不典型,高剂量组表达强于低剂量组(P<0.05).电镜报告与病理表现一致.结论:运用BSA+LPS+CCL4联合造模方法在12周左右可建立快速IgA肾病动物模型,而且高剂量BSA(600 mg/kg)组肾组织病变更显著,模型更典型.此模型的建立及运用可以为IgA肾病临床及基础研究提供良好动物模型基础.

    关键词: BSA IgA肾病 大鼠 模型
  • 免疫源性IgAN大鼠模型的建立与评价

    作者:孙红旭;卢嫣;王怡

    目的:免疫原牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)免疫诱导IgA肾病大鼠模型是国内常用模型,本实验对以往的制作方法加以改良,观察模型效果.方法:雄性SD大鼠20只,质量180~200 g,按随机数字表随机分为正常组、模型组.模型组造模方法:BSA,600 mg/kg,隔天1次灌胃,皮下注射蓖麻油0.3 ml+CCL40.10 ml,每周1次持续8周,第6周、第8周脂多糖(lypopolysaccharide,LPS)0.05 mg尾静脉注射.对照组用注射用水等剂量刺激.第8周末大鼠,留取血、尿、肾组织标本检测.观察大鼠一般情况、蛋白尿、血尿以及肾组织病理.结果:型组与正常组相比,大鼠24 h尿蛋白定量、尿红细胞计数明显增多(P<0.01),病理形态学改变明显,肾组织IgA免疫荧光染色增强,荧光阳性面积和平均光密度值升高(P<0.01).结论:运用改良的造模方法BSA+LPS+CCl4建立IgA肾病模型效果良好,病理、临床指标均与人类IgA肾病较为相似.

  • 多糖颗粒复合PLGA微球用于脉冲式释药系统的研究

    作者:任劼;蒋玉航;肖兴皓;吴飞

    目的:考察多糖颗粒复合PLGA微球用作脉冲式释药系统的可行性.方法:用水相-水相乳化法将模型蛋白BSA包裹于多糖颗粒中,再用S/O/W法制备多糖颗粒复合PLGA微球.采用microBCA法测定该微球体外释放行为,并与W/O/W复乳法制备的BSA微球相对照.结果:用W/O/W复乳法制备的BSA微球的体外释放曲线显示,该微球在开始释放第一天起就出现一个平台期,之后则产生一个持续高释放量的行为.而多糖颗粒复合PLGA微球的体外释放曲线显示,其在释放第一天和一个较长平台期之后都出现峰形释放,相对于前者微球与脉冲释药模式更为相近.平台期时长与高分子性质有关,PLGA结构中乳酸相对于乙醇酸比例越高则平台期越长.结论:多糖颗粒复合PLGA微球具有良好的脉冲式释药效果,是一种较有前景的脉冲释药系统.

  • 包裹于PLGA微球中用于蛋白控释的多糖纳米颗粒

    作者:赵昊;任甜甜;陈唯娟;洪晓芸;袁伟恩

    目的:研究包裹在PLGA微球中的多糖纳米颗粒在保护蛋白稳定性和改善药物体外释放行为方面的作用.方法:将模型药物BSA用低温诱导相分离方法担载于多糖纳米颗粒之中,后将其用水包油包固复乳法包裹于PLGA微球内.应用体积排阻色谱(SEC-HPLC)和红外色谱(FTIR)表征蛋白的稳定性,而且也研究了样品的体外释放行为.结果:这种方法能够很好的保护蛋白的稳定性,保持蛋白结构在制备过程中不会改变,而且改善了体外释放行为,减少了突释.结论:多糖纳米颗粒结合PLGA微球能够提供一种有效的解决蛋白控释的途径.

  • 促肝细胞生长素及其S4组份对人PBMC表型的影响

    作者:黄锡全;刘恭植;孔祥平;邹清雁;张宜俊

    本文采用生物素-链霉亲和素(BSA)免疫细胞化学法及流式细胞仪技术检测CD3+、CD4+、CD8+、HLA-DR+及CD25+细胞百分率,藉以研究促肝细胞生长素(Phgf)及其组分S4对免疫活性细胞的作用.结果表明,Phgf可使脐血中CD4+、CD8+及HLA-DR+细胞数有明显增长;对正常人及肿瘤患者PBMc的HLA-DR+细胞数亦有促进作用,与PHA的刺激作用相近似.用FPLC及HPLC等方法分离的单一成分S4对成人PBMC表面CD25抗原表达有明显促进作用.

  • 附芍术提取物对BSA致大鼠肝纤维化治疗作用的实验研究

    作者:周琴

    肝纤维化是肝脏的慢性、实质性病变,在病理组织学上有广泛的肝细胞坏死、再生及再生结节形成,结缔组织增生,导致肝小叶结构破坏等[1],是慢性肝病重要的病理特征,也是慢性肝炎、肝硬变等进一步发展、恶化的重要环节.

  • 结核病与mIL-2R、sIL-2R的表达

    作者:许礼发;李朝品;王健

    目的探讨结核病与膜白介素-2受体(mIL-2R)、可溶性白介素-2受体(sIL-2R)表达水平的关系.方法采用生物素-链霉亲和素(Biotin-Streptavidin,BSA)系统及双抗体夹心ELISA法检测结核病患者mIL-2R及sIL-2R的表达水平.结果结核病患者PHA诱导前后mIL-2R水平分别为(3.28±1.35)%和(29.18±5.86)%,与对照组相比,差异有显著性(P<0.01和P<0.05);结核病患者血清中sIL-2R水平为(474.3+102.5)%,与对照相比,差异有显著性(P<0.01).有空洞型肺结核的mIL-2R、sIL-2R表达水平的变化较无空洞者更为明显(P<0.01).无空洞型肺结核,与结核性胸膜炎、肾结核的mIL-2R、sIL-2R表达水平相似,差异无显著性(P>0.05).结论结核病患者体内mIL-2R表达水平降低,sIL-2R水平升高,结核病患者体内存在明显细胞免疫功能低下,其外周血单个核细胞(PBMC)对PHA的诱导反应能力降低.结核的病变部位、病变程度及预后与患者的mIL-2R、sIL-2R表达水平有一定关系.

  • 表面等离子共振技术研究牛磺熊去氧胆酸钠与牛血清白蛋白的相互作用

    作者:张铃;蔡巧燕;陈达鑫;林珊;王丽丽;彭军

    目的 通过ProteOn XPR36检测牛磺熊去氧胆酸钠(TUDCA-Na)与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用. 方法 把BSA通过氨基偶联在GLH芯片表面,优化TUDCA-Na与BSA的相互作用条件,获取二者相互作用的结合常数(ka)、解离常数(kd),并通过计算kd/ka的比值,得出二者的平衡常数(KD). 结果 通过优化后,用pH为4的10 mM醋酸钠配制300 nM BSA蛋白,偶联时间为5min,终BSA蛋白的偶联量达11 000 RU左右.TUDCA-Na溶液以100、50、25、12.5、6.25、0M的梯度浓度和BSA发生相互作用,互作的流速为30 μL/min,结合和解离时间分别为80 s和60 s,终选用Langmuir模型进行拟合,ka为2.35×104 1/Ms;kd为1.29 1/s. 结论 TUDCA-Na与BSA蛋白间存在相互作用,二者的平衡常数为5.47×10-5M.

  • 宿主DNA对埃立克体病PCR诊断的抑制作用研究

    作者:朱晓宇;张慧娟;张建华;俞东征

    目的:优化埃立克体病的PCR诊断方法.方法:构建含有查菲埃立克体16S rRNA基因片段的重组载体.比较巢式PCR和普通一步法PCR的灵敏度差异.用RAW264.7细胞DNA模拟实验室诊断时的宿主细胞DNA,评估宿主细胞DNA对巢式PCR效率的影响.添加BSA作为优化剂,探讨BSA是否能降低宿主DNA的干扰.结果:巢式PCR可以扩增出特异性产物的低模板量为103拷贝,一步法PCR是105拷贝.50~100 ng的宿主细胞DNA能够降低巢式PCR的效率.BSA可以降低宿主细胞DNA对PCR的抑制作用.结论:巢式PCR的灵敏度明显高于一步法PCR;BSA可以降低宿主细胞DNA干扰,提高PCR的效率.建议埃立克体病的诊断应尽量选择巢式PCR,必要时可加入适量的BSA以提高灵敏度.

  • 不同溶剂中油酸对LO2和HepG2细胞生长和活力的影响

    作者:陈莉;汪春红;黄邵鑫;段纯喆;金丽娜;王红

    目的 探讨以二甲基亚砜(DMSO)和牛血清白蛋白(BSA)分别溶解的油酸(OA)对人正常肝细胞(LO2)株和人肝癌细胞( HepG2)株的影响,寻找合适的脂肪酸溶剂以及体外研究脂代谢的肝细胞系.方法 LO2和HepG2细胞均分为:空白组,DMSO组,DMSO+不同浓度油酸组,BSA组,BSA+不同浓度油酸组.培养48 h后,采用MTT法检测细胞活力,油红O染色观察活细胞数目和胞内脂滴变化;甘油-3-磷酸氧化酶法检测细胞内甘油三酯(TG)的含量.结果 以DMSO溶解的(0.4~6.4) μg/ml油酸分别处理的LO2和HepG2细胞,细胞生长曲线均呈先上升后下降的趋势,除1.6μg/ml浓度组LO2细胞生长接近空白对照组外,其它组细胞活力均显著低于对照组(P<0.05);同样以BSA溶解的(0.4~6.4) μg/ml油酸分别处理LO2和HepG2细胞,各组细胞活力均高于空白组,呈上升趋势(P<0.01).油红O染色显示两细胞株在DMSO溶解OA处理后,与空白组比较,油酸组细胞内脂滴增多,但细胞数目减少;而在BSA溶解下,细胞内脂滴和活细胞数目均随OA浓度增加而增加,各组细胞内TG含量变化趋势与油红O染色结果类似,以LO2细胞株更为敏感.结论 作为OA溶剂,BSA较DMSO合适;LO2较HepG2细胞更适合作为体外研究脂代谢的细胞株.

  • 应用三聚磷酸钠为交联剂制备载药物纳米粒的研究

    作者:蒋新宇;周春山;张俊山

    目的以三聚磷酸钠(TPP)为交联剂,用生物降解聚合物材料壳聚糖(CS)制成纳米粒,研究其对蛋白质的包载和控释性能.方法壳聚糖是带有阳离子的大分子聚合物,与带有阴离子的三聚磷酸钠作用可形成纳米级聚电解质复合物.将聚乙二醇(PEG)、牛血清白蛋白(BSA)加入反应体系中即能生成壳聚糖-聚乙二醇载蛋白质纳米粒.结果纳米粒的制备条件温和,快速简便.纳米粒蛋白质包封率高并可在较长时间范围内连续释放.结论壳聚糖-聚乙二醇纳米粒有望成为蛋白质、基因、抗体和药物的输送载体.

  • 低氧诱导因子1α在白蛋白过负荷致肾小管上皮细胞转分化中的作用

    作者:王沛;梁献慧;刘章锁;骆红;马瑨

    长期蛋白尿可致肾脏纤维化,细胞外基质(ECM)的主要来源之一是转分化的肾小管上皮细胞(TEC)[1],因此上皮细胞-间充质细胞转分化(EMT)是蛋白尿患者肾脏纤维化的主要机制之一。低氧诱导因子1(HIF-1)可诱导多种细胞转分化[2]。本研究检测大鼠TEC(NRK-52E细胞)在含高浓度牛血清白蛋白(BSA)的培养基中是否发生转分化,以及shRNA- HIF -1α能否抑制BSA致NRK-52E细胞转分化的作用,以探讨HIF- 1α在蛋白尿致肾脏纤维化中的作用。

  • 不同免疫途径对制备抗血清影响的探讨

    作者:李英信;李红花;李芳芳;孙昌元;金权鑫;金松竹;崔春权;孟繁平

    [目的]比较不同免疫途径制备自蛋白抗血清的效价,研究既筒便又效价高的制备免疫血清的佳方法.[方法]以小牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)加完全佐剂为抗原,通过皮内、多途径、肌肉注射3种途径免疫家兔,测定不同免疫途径的抗血清效价. [结果]皮内免疫的抗血清效价高1:64,低1:16;多途径免疫的抗血清效价高1:32,低1:16;肌内免疫的抗血清效价高1:16,蕞低1:8. [结论]皮内免疫途径剞备白蛋白抗血清的方法简便,效价高,对实验动物的损伤小,是一种理想的制备教学用免疫血清的方法.

  • 二次分层离心纯化成年大鼠背根节神经元的方法

    作者:赵久红;董栩;张显芳;张海英;谭晓红;张全鹏;黄奕弟;马志健;易西南

    目的:建立一种长时程的有效获得高度纯化成年大鼠背根节(dorsal root ganglions,DRG)神经元的方法.方法:将SD大鼠的DRG剥膜、消化制成单细胞悬液,牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)分层离心去除大部分非神经元细胞后接种于多聚赖氨酸处理的盖玻片上;培养1d后,胰酶消化再次制成细胞悬液,BSA二次分层离心,再次接种于多聚赖氨酸处理的盖玻片上.BSA二次分层离心后的神经元为实验一(T1组)、单次离心的神经元为实验组二(T2组)、未经离心处理的神经元为对照组(C组).各组除离心次数外,其余各方法相同.相差显微镜下观察上述各组培养神经元,结合βtubulinⅢ免疫荧光组化染色及MTT分析检测神经元纯化效果及细胞活力.结果:培养3d后,T1组神经元比例达88.43±6.13%,较T2组、C组显著增高,差别具有统计学意义(P<0.05);MTT的结果显示与T2组、C组比较,T1组神经元的相对活力略微下降,但无统计学差异(P>0.05).结论:二次纯化法是一种简单有效的成年大鼠DRG神经元纯化方法.

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